砷剂在儿童急性早幼粒细胞白血病治疗中的安全性病例系列报告

张元元 王林娅 张瑞东 林 巍 于皎乐 吴 颖 漆佩静 范 佳 李 静 林嘉衍 郑雪岭 彭晓霞 蒋 慧 郑胡镛

急性早幼粒细胞白血病(APL)是以骨髓中早幼粒细胞增多为特征的髓系白血病，伴有t(15;17)染色体改变及PML/RARα融合基因。临床上，APL常有严重出血倾向，甚至发生颅内出血、弥散性血管内凝血(DIC)而危及生命[1]。三氧化二砷(ATO)联合全反式维甲酸(ATRA)治疗APL已取得显著疗效，获得较高的治愈率[2-4]。此外，近年来口服复方黄黛片(RIF)使APL的治疗更加简便和便宜，不仅提高了APL患者的生活质量，且减轻了患儿家庭经济负担[3,5]。尽管砷剂的使用提高了APL的治愈率，但其在儿童APL中应用的安全性尚缺乏相关报道。本研究是建立优化中国儿童白血病协作组-急性早幼粒细胞白血病(CCLG-APL)2016治疗方案研究中的一部分，观察CCLG-APL方案中砷剂应用的有效性及安全性。

1 方法

1.1 伦理和注册 本研究通过首都医科大学附属北京儿童医院医学伦理委员会的伦理审批(审批号：2016-k-30)，并在中国临床试验注册中心注册(注册号：ChiCTR-OIN-17011227)。

1.2 纳入标准 ①2016年3月16日至2018年5月1日在我院血液肿瘤中心初诊的APL患儿；②采用CCLG-APL 2016方案治疗；③治疗前患儿监护人签署知情同意书。

1.3 APL诊断标准及危险度分层

1.3.1 诊断标准 根据CCLG-APL 2016方案，符合以下条件①+②或①+③即可确诊。①骨髓细胞形态学：AML-M3(FAB分型)；②染色体或FISH：t(15;17)；③分子生物学检测：PML/RARα阳性。

1.3.2 危险度分层 根据CCLG-APL 2016方案，依据外周血WBC计数和分子生物学检测情况分为：①低危组：初诊WBC<10×109·L-1。②高危组：初诊WBC≥10×109·L-1或/和FLT3-ITD突变者；或初评为低危组的患儿在维持治疗前PML/RARα融合基因未转阴，或维持期、停药后基因出现阴转阳，则升级为高危。③超高危组：初始治疗前分组为高危组，在维持治疗前PML/RARα融合基因没有转阴的患儿，升级为超高危。

1.4 CCLG-APL 2016治疗方案

1.4.1 诱导治疗 ①低危组：ATRA 15～25 mg·m-2·d-1口服，D1～28；ATO 0.15 mg·kg-1·d-1(最大剂量 10 mg·d-1)静滴，D1～28。②高危组：ATRA 15～25 mg·m-2·d-1口服，D1～28；ATO 0.15 mg·kg-1·d-1(最大剂量 10 mg·d-1)静滴，D1～28；蒽环类药物[去甲氧柔红霉素(ID)10 mg·m-2·d-1静滴qod×2～3次或柔红霉素(DNR)40 mg·m-2·d-1静滴qod×2～3次]。

1.4.2 巩固治疗 ①低危组：ATRA 15～25 mg·m-2·d-1口服，D1～14；RIF 50～60 mg·kg-1·d-1口服，D1～14。②高危组：ATRA 15～25 mg·m-2·d-1口服，D1～14；蒽环类药物(ID 10 mg·m-2·d-1静滴qod×3次或DNR 40 mg·m-2·d-1静滴qod×3次)。若分子生物学(PML/RARα)不缓解，重复1次。

1.4.3 维持治疗 ATRA 15～25 mg·m-2·d-1，口服1周，停1周，依次循环；RIF 50～60 mg·kg-1·d-1，口服2周，停2周，依次循环。8周为1个疗程，低危组4个疗程，高危组5个疗程。

1.4.4 中枢神经白血病(CNSL)的防治 阿糖胞苷、地塞米松两联鞘内注射至少4次，即诱导期1次(务必待DIC控制后)，巩固治疗1次，维持期每3～6个月1次，共2次。对巩固治疗后PML/RARα未转阴、增加1次巩固治疗的患儿，需增加1次两联鞘内注射。

1.5 砷浓度检测 采用等离子体质谱仪(ICP-MS，美国Agilent公司，型号7700x)进行砷浓度检测。

1.5.1 ATO与RIF血、尿监测时间 ①诱导缓解期：诱导D0、D7、D14、D28；②缓解后巩固治疗：巩固D14(巩固结束，低危组为砷剂使用第14 d后，高危组为巩固治疗第14 d)；③缓解后维持治疗：维持期(维持治疗第10周)和维持结束(停药时)；④随访：停药后半年、1年、1.5年、2～3年(如果还未降到安全浓度以下，第5年再检测1次)。

1.5.2 头发和指甲砷浓度监测时间 诱导D0、诱导D28、停药时、停药后半年、1年、2～3年、5年行砷浓度检测。

1.5.3 砷浓度检测方法 血、尿标本保存期<2周于4℃保存，>2周于-20℃保存；头发和指甲常温避光保存。①取静脉血样品约1.0 mL，加入HNO31.5 mL、H2O20.5 mL，微波消解，以纯水定容至15 mL。消化液稀释4倍后，上机测定。同步制备空白溶液。②尿：准确吸取尿样品约1.0 mL，加入HNO31.5 mL、H2O20.5 mL，微波消解，以纯水定容15 mL。消化液稀释20倍后，上机测定。同步制备空白溶液。③头发和指甲先用0.5%TRITON X-100 浸泡15 min，自来水冲洗10次，去离子水冲洗10次，丙酮和无水乙醇各冲洗1次后，用滤纸包好晾干。准确称取头发、指甲样品约0.1 g，加入HNO31.5 mL、H2O20.5 mL，微波消解，以纯水定容至15 mL。消化液稀释4倍后，上机测定。同步制备空白溶液。

1.6 砷剂不良反应

1.6.1 短期反应 在治疗过程中观察到的砷剂不良反应，包括过敏反应、胃肠道反应、肝脏毒性、心脏毒性、肾脏毒性、神经系统损害。

1.6.2 远期反应 在维持治疗结束即停药后的随访过程中观察到的砷剂不良反应，主要包括心血管事件、慢性肾损伤、糖尿病、神经机能障碍等。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，非正态分布的计量资料采用中位数(P25，P75)表示。两两比较采用秩和检验。非正态分布的双变量资料采用Spearman秩相关检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 15例初诊APL患儿纳入本研究，男8例，女7例，发病年龄3～16(10.4±4.0)岁。所有患儿PML/RARα融合基因均阳性。初评为低危13例，高危2例，其中1例因FLT3-ITD突变、1例因巩固治疗期间(即维持治疗前)分子生物学持续不缓解，升级为高危。初诊WBC计数中位数为3.61×109·L-1，低、高危组初诊WBC计数中位数分别为 3.58×109·L-1和11.31×109·L-1。所有患儿在诱导治疗第28 d时均获得骨髓形态学完全缓解，在进入维持治疗前均获得分子生物学完全缓解。

2.2 砷浓度检测

2.2.1 血、尿砷浓度 表1显示，诱导D0患儿血砷中位浓度为0.7 ng·mL-1。血砷浓度在诱导治疗D7迅速达到治疗有效浓度，在巩固治疗D14达高峰，此后逐渐下降，治疗期间44.9～74.6 ng·mL-1。治疗期间，血砷浓度除2例患儿在巩固治疗D14分别为 121.3和9.46 ng·mL-1，其他患儿均在10～100 ng·mL-1有效范围内(图1A)。

表1 在儿童APL砷剂各治疗阶段不同组织中的砷浓度检测[中位数(P25，P75)]

注 N1为在该治疗阶段检测的血、尿标本数，N2为在该治疗阶段检测的头发、指甲标本数。因患者的依从性及治疗所处阶段的不同，各治疗阶段检测的标本数不同。-：未检测。1例患儿于砷剂停用14 d后检测血砷浓度，与本研究方案要求的检测时间点不符，不纳入分析

在巩固治疗期间血砷浓度121.3 ng·mL-1的患儿初评为低危，在巩固治疗期间分子生物学持续不缓解，升级为高危；血砷浓度9.46 ng·mL-1的患儿初评为高危，在巩固治疗期间未使用砷剂。血砷浓度在诱导D0、停药、停药半年3组间差异有统计学意义(P=0.000 1)。两两比较，血砷浓度在诱导D0与停药之间、停药半年与停药之间差异均有统计学意义(P分别为0.000 6和0.019 0)，在诱导D0与停药半年之间差异无统计学意义(P=0.140 1)。

尿砷浓度在巩固D14达高峰，在停药后迅速降至正常(表1，图1B)。尿砷浓度在诱导D0、停药、停药半年3组间差异有统计学意义(P=0.001 1)。两两比较，尿砷浓度在诱导D0与停药间差异有统计学意义(P=0.002 0)，在停药半年与诱导D0(P=0.451 9)、停药(P=0.065 1)之间差异均无统计学意义。

此外，Spearman秩相关分析(图2A)显示血砷浓度与尿砷浓度成正相关(r=0.778，P=0.000 0)。

2.2.2 头发、指甲砷浓度 如表1所示，头发、指甲中砷浓度在停药时达高峰，在停药后逐渐下降(图1C、D)。头发砷浓度在诱导D0、停药、停药半年3组间差异有统计学意义(P=0.000 4)。两两比较，头发砷浓度在诱导D0与停药之间、停药半年与停药之间差异均有统计学意义(P分别为0.000 8和0.042 9)，在停药半年与诱导D0(P=0.727 2)之间差异无统计学意义。

图1APL患儿不同治疗时期血、尿、头发、指甲中的砷浓度情况

注 图A、图B中X轴为砷剂检测时间点，1、2、3、4、5、6、7、8、9分别代表诱导D0、D7、D14、D28、巩固D14、维持治疗、停药、停药半年、停药1年；A：血砷浓度；B：尿砷浓度；C：头发砷浓度；D：指甲砷浓度

指甲砷浓度在诱导治疗D0、停药、停药半年三组间差异有统计学意义(P=0.000 9)。两两比较，指甲砷浓度在诱导D0与停药之间差异有统计学意义(P=0.001 5)，停药半年与诱导D0(P=0.727 2)、停药(P=0.068)差异无统计学意义。

Spearman秩相关分析显示，头发砷浓度与指甲砷浓度呈正相关(r=0.847，P=0.000 0)(图2B)。此外，血砷浓度与头发(r=0.641，P=0.000 0)、指甲(r=0.655，P=0.000 0)中砷浓度均成正相关。尿砷浓度与头发(r=0.622，P=0.000 0)、指甲(r=0.688，P=0.000 0)中砷浓度均呈正相关。

图2不同组织中砷浓度的相关性

注 A：血砷浓度与尿砷浓度相关性分析；B：头发砷浓度与指甲砷浓度相关性分析

2.3 砷剂的不良反应 随访1～25.5个月，平均随访(12.2±7.8)个月。

2.3.1 砷剂的短期反应 15例患儿均无砷剂使用过敏，无肾脏损害。2例发生胃肠道反应，表现为恶心、呕吐，予对症后好转。7例肝损害，1例心脏损害，表现为肝酶、肌酸激酶同工酶增高，予对症支持治疗后好转。1例在诱导治疗第4周出现足拇趾疼痛，2天后自行缓解。1例在诱导期间出现双下肢麻木，在巩固期间出现耳鸣，纯音测听提示右耳低频神经性耳聋，将砷剂减量后症状消失。1例在维持治疗第2周出现易睡、汗多、周身疼，将砷剂减量后症状消失。

2.3.2 砷剂的远期反应 在停药后的随访中，目前尚未观察到砷剂的慢性不良反应，如心血管事件、慢性肾损伤、糖尿病、神经机能障碍等。

3 讨论

目前在我国成人APL治疗中，ATRA联合砷剂治疗已写入2018年版APL诊治指南[6]。然而，砷剂应用在儿童APL中的安全性尚缺乏相关报道。砷剂是一种有毒、致癌物质[7-9]，被吸收后迅速变为硫化物沉着于组织内，主要贮藏于肝、肾、胃肠、脾与肺内，极少量贮存在肌肉和神经组织中。因此，砷剂的使用可引起严重的不良反应，如胃肠道反应、肝功损害、肾衰竭、心律失常等[10,11]，由此说明研究砷剂在儿童APL中安全性的必要性和重要性。

目前临床上常用的砷剂包括静脉制剂ATO和口服制剂RIF。ATO对APL细胞发挥剂量依赖的双重效应[12]，低浓度(0.1～0.5 μmol·L-1)诱导细胞分化，高浓度(0.5～2 μmol·L-1)诱导细胞凋亡。RIF为中药复方制剂，成分为雄黄、青黛、太子参、丹参。雄黄的有效成分是四硫化四砷，能够通过维甲酸受体信号通路降解PML/RARα融合基因诱导细胞凋亡，且口服方便，在治疗中无需返院静脉用药，可减少住院次数、缩短住院时间，应用前景较广泛[13]。在本研究中，除诱导治疗期间使用静脉ATO外，巩固和维持期间均使用口服RIF，极大地减少了患儿住院次数，降低了治疗费用。本研究在治疗各阶段检测了患儿不同组织中的砷浓度发现，无论是使用静脉ATO还是口服RIF，除2例血砷浓度在巩固治疗第14 d检测分别为 121.3 ng·mL-1、9.46 ng·mL-1，所有患儿在治疗阶段的血砷浓度均可维持在治疗有效浓度范围内(10～100)ng·mL-1，且血、尿砷浓度在停药半年后迅速降至正常水平，头发、指甲中砷浓度在停药时达高峰，在停药后逐渐下降，停药半年后降至治疗前水平。这与既往报道的成人APL患者在ATO停药后，血、尿砷浓度在停药后0～6个月迅速降至正常，头发和指甲中的砷浓度在停药6个月后降至正常稳态水平相符[2]。本研究结果显示，指甲中砷浓度在停药1年时较停药半年高，这可能与停药半年和停药1年时所检测的标本较少有关，未来需长期随访、加大样本量进行分析。

因血砷半衰期短，大部分砷的代谢物在3～4 d内经尿液排泄出体内，故血、尿砷通常被作为短期暴露的标记物[14,15]。由于头发和指甲中富含半胱氨酸角蛋白，砷对半胱氨酸的高亲和力促进砷在头发和指甲中的蓄积，通常需2～12个月排泄出体内，因此头发和指甲通常作为长期暴露的标记物[15,16]。此外，头发和指甲中的砷浓度与其他组织中的砷浓度相关性良好(如尿液和血液)[17,18]，这与本研究结果相符。在本研究中，血、尿、头发、指甲中的砷浓度均互相成正相关性，且随着砷剂使用时间的延长，头发、指甲中蓄积的砷含量逐渐增加，在停药时到达高峰，在停药后逐渐降至治疗前水平，提示头发和指甲可作为砷长期暴露标记物。

砷剂的不良反应包括短期反应和远期反应。在本研究中观察到的短期反应包括胃肠道反应、肝损害、心脏损害、神经系统损害，在减少药物剂量及对症支持治疗后均好转。本研究最长随访时间达25.5月，平均随访时间(12.2±7.8)月，目前尚未观察到慢性砷中毒的常见症状，如心血管事件、慢性肾损伤、糖尿病、神经机能障碍等。但本研究时间尚短，仍需长期动态观察及检测。

致谢：感谢北京大学人民医院主鸿鹄大夫对本研究的指导，感谢北京大学医学部解清老师对砷浓度检测的技术帮助。