银杏叶提取物的免疫调节作用研究

温 锐，王 俭

0 引言

银杏叶性甘、味苦、涩、平，归心、肺经，有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛等功效。研究表明，银杏叶所含的药用活性成分较多，包括萜烯酯和黄酮苷等，对多种疾病具有良好的预防和治疗作用[1-3]。近年来，因为环境污染、工作压力激增等因素，临床实践中发现，机体免疫异常的患者数量有逐年增加的趋势。人体免疫功能低下会诱发很多疾病。因此，亟待寻找合适、可有效调节机体免疫功能的药物。目前，银杏叶提取物对免疫功能影响的相关报道很少。 本研究拟通过观察银杏叶提取物对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响，为临床实践提供理论依据。

1 材料

1.1 药品、试剂及仪器 药品：银杏叶提取物片(商品名：金纳多片，40 mg/片，德国威玛舒培博士大药厂，批号：H20090365)；环磷酰胺(200 mg/支，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：H32020857)。试剂：绵羊红细胞(SRBC)，沈阳市大东区前进生物制剂厂；2,4-二硝基氯苯(DNCB)，南开大学精细化工实验厂，批号：921020；都氏试剂：碳酸氢钠1.0 g，氰化钾0.5 g，高铁氰化钾0.2 g，加纯化水溶解至1 L，混匀。仪器：CL-770全自动生化分析仪，日本岛津公司。

1.2 实验动物 昆明种小鼠，18～22 g，雌雄各半(中国医科大学附属盛京医院医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK[辽]2003-0013)。

2 方法

2.1 免疫功能低下小鼠碳粒廓清模型 按文献方法[4]，选取昆明种实验小鼠50只，雌雄各半，分为空白对照组、模型对照组和实验组(银杏叶提取物高、中、低剂量组)，每组10只。实验组小鼠分别口服灌胃给予银杏叶提取物40、20、10 mg，空白对照组和模型对照组口服灌胃给予0.5%CMC-Na 20 ml/kg。除空白对照组之外，其余四组均于给药的第3～5天，腹腔注射环磷酰胺50 mg/kg，每日1次；末次给药后1 h，小鼠尾静脉处注射墨汁10 μl/g。注射墨汁2 min(t1)、12 min(t2)后，分别从小鼠眼眶静脉丛处取血25 μl，溶于3 ml的0.1% Na2CO3溶液中混合均匀。取0.1% Na2CO3溶液作为空白对照，与波长680 nm比色测OD值。最后，将小鼠处死，立即取肝脏和脾脏，去除血污后进行称重，并按如下公式计算样品的廓清指数(κ值)及吞噬指数(α值)。

2.2 免疫功能低下小鼠溶血素抗体生成模型 昆明种小鼠，雌雄各半，分组及给药方法同“2.1”。各组小鼠均于给药第3天，腹腔注射0.2 ml绵阳红细胞(SRBC，含量20%)。除空白对照组之外，其他四组均在致敏当日腹腔注射给予环磷酰胺20 mg/kg，连续腹腔注射3 d。末次给药1 h后，于小鼠眼眶静脉丛处取血并分离血清。每2 μl血清加1 ml生理盐水(稀释倍数500)，再加入0.5 ml 5% SRBC，1 ml的10%豚鼠血清补体。将所得溶液样本，放于37 ℃恒温水浴中保温30 min，最后移至冰浴中使反应终止。以1 500 r/min速度离心5 min，取上清液1 ml并加都氏试剂3 ml，摇匀之后静置10 min，使用540 nm波长荧光进行比色并读取吸光度。SRBC半数溶血数值的测试方法为：在0.25 ml 5% SRBC中加都氏试剂至总体积4 ml，测定吸光度值，并计算HC50数值[5]

2.3 免疫功能低下小鼠迟发型超敏反应模型 昆明种小鼠，雌雄各半，分组方法及给药方法同“2.1”。按照文献建议方法[6]，各组小鼠背部均皮下注射0.35 mol/L的DNCB丙酮液30 μl致敏；致敏后从第4天开始，各组小鼠连续给药7 d。除空白对照组外，其余四组均于给药后第3天、第5天，腹腔注射50 mg/kg的环磷酰胺。末次给药1 h后，在小鼠右耳廓前后涂抹0.35 mol/L的DNCB丙酮液25 μl激发，16 h后处死，用9 mm打孔器于小鼠两耳相同部位打下耳片并称重，用下列公式计算肿胀度。

肿胀度(mg)=右耳片质量(mg)-左耳片质量(mg)

3 结果

3.1 银杏叶提取物对免疫低下小鼠碳粒廓清的影响 由表1结果可见，免疫功能低下小鼠口服灌胃给予不同剂量银杏叶提取物后，小鼠κ值和α值均呈改善趋势。与模型对照组相比，银杏叶提取物40、20 mg/kg剂量组κ值、α值升高(P<0.01或P<0.05)。

表1 银杏叶提取物对免疫功能低下小鼠碳粒廓清的影响(n=10)

注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

3.2 银杏叶提取物对免疫低下小鼠溶血素抗体生成的影响 免疫功能低下小鼠口服灌胃给予不同剂量银杏叶提取物后，HC50均呈升高趋势。与模型对照组比较，银杏叶提取物40、20 mg/kg剂量组对免疫功能低下小鼠的免疫功能改善差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；银杏叶提取物10 mg/kg 剂量组HC50有升高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表2。

表2 各组小鼠HC50、耳肿胀度比较

注：与模型对照比较，*P<0.05,**P<0.01

3.3 银杏叶提取物对免疫低下小鼠迟发型超敏反应的影响 免疫功能低下小鼠，分别给予不同剂量银杏叶提取物后，耳肿胀程度呈加重趋势，加重耳肿胀程度与剂量呈相关趋势。与模型对照组比较，银杏叶提取物40、20 mg/kg剂量组均显著加重由DNCB诱发的耳肿胀(P<0.01或P<0.05)。见表2。

4 讨论

自20世纪60年代起，国内外许多学者对银杏及其提取物的药理作用进行了大量的研究。研究结果表明，银杏叶提取物具有扩张脑血管、增加脑血管流量、降低毛细血管通透性、清除自由基等作用，能够有效治疗心脑血管类疾病[7-11]。此外，研究显示，银杏叶提取物还具有降低血脂的作用，并可通过改善糖耐量等方式，显著降低老年患者的血糖代谢及高胰岛素血症[12-13]。近年来，有报道，银杏叶提取物对于肿瘤细胞也具有一定的抑制作用[14]。

银杏叶提取物除了具有拮抗血小板活化因子、清除氧自由基和降血脂等作用外，近年来，随着免疫系统相关疾病发病率逐年升高，其对免疫系统功能的作用也引起了越来越多学者的重视[15]。本研究采用环磷酰胺制作小鼠免疫功能低下模型，从非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫三方面，观察银杏叶提取物对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用。结果显示，与模型对照组相比，银杏叶提取物40、20 mg/kg剂量对免疫功能低下小鼠具有显著的改善，这种改善效果呈现剂量依赖性，尤以40 mg/kg组改善效果最为显著。由本研究结果可见，给予免疫功能低下小鼠适当剂量的银杏叶提取物，可有效改善其特异性和非特异性免疫功能。

本研究中，我们通过建立不同的免疫功能低下小鼠模型，获得了银杏叶提取物可改善免疫功能的结果，为今后其他学者深入开展有关银杏叶提取物的临床应用提供了基础的数据和支持。由于实验条件等因素的限制，本研究结果只是从免疫功能低下小鼠模型中获得，银杏叶提取物调节免疫功能的具体机制，需要在今后深入研究。