番泻苷A对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠肾损伤和炎症反应的调节作用

徐 博，郭 伟，刘丹平，薛 辉

0 引言

糖尿病肾病是一种致命性的糖尿病并发症，约1/3的糖尿病患者会出现糖尿病肾病。糖尿病肾病已成为终末期肾病的主要病因，且与心血管疾病风险和过早死亡例数增加密切相关，造成了较重的社会和经济负担[1-3]。研究表明，许多中药单体在糖尿病肾病的治疗中发挥积极作用，如黄连素、姜黄素、淫羊藿苷及丹酚酸B等[4-5]。大黄是一种传统中草药，大黄提取物中发挥功效的主要为蒽醌类化合物，其蒽醌类化合物主要包括大黄酚、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚及番泻苷A(Sennoside A，SA)，这些大黄的蒽醌类化合物在通便、抗炎、抗癌、抗氧化方面起着重要作用[6-7]。研究表明，番泻苷A在胃肠保护方面有积极作用[8]。但番泻苷A在糖尿病肾病中的功能还未见报道。本研究的主要目的是探索番泻苷A对链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠肾损伤和炎症反应的调节作用。

1 材料与方法

1.1 动物来源及主要试剂 6周龄大鼠购自中国科学院实验动物中心，番泻苷A(分析纯)购自美国Sigma-Aldrich公司。STZ(HPLC≥98%)购自美国Sigma公司。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)染色试剂盒购自美国罗氏公司。抗Caspase-3抗体、抗Caspase-9抗体和抗纤连蛋白(Fibronectin，FN)抗体购自英国Abcam公司。白细胞介素(Interleukin，IL)-18、IL-1β酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。

1.2 动物分组及药物处理 40只大鼠随机分为4组：对照组(Control组)，番泻苷A对照组(SA组)，糖尿病肾病模型组(STZ组)和番泻苷A处理组(STZ+SA组)。STZ组和STZ+SA组大鼠腹腔注射60 mg/kg的STZ，连续注射3周。Control组和SA组大鼠用生理盐水代替STZ。然后SA组和STZ+SA组大鼠口服番泻苷A(100 mg/kg)，连续喂养1周。

1.3 肾功能指标检测 番泻苷A处理1周后，分别收集尿液和血液，应用全自动生化分析仪检测24 h尿蛋白、血清肌酸酐和血尿素氮水平。

1.4 TUNEL染色 番泻苷A处理1周后，颈椎脱臼法处死大鼠后取出肾脏，PBS清洗8次，去掉坏死组织及血凝块。用4%多聚甲醛在4 ℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50%、70%的酒精依次脱水10 min。去除酒精脱水机中脱水，然后进行石蜡包埋切片。用二甲苯对石蜡切片进行脱蜡，梯度乙醇水化后用蛋白酶K 20～37 ℃处理15～30 min。PBS漂洗后用3%的H2O2室温孵育20 min，随后PBS清洗。然后按照试剂盒说明书进行生物素标记，显色，苏木素复染后自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。最后显微镜下观察拍照，细胞核呈棕色颗粒的为凋亡细胞。

1.5 蛋白印记 肾脏组织匀浆后加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，再于100 ℃下变性5 min。等量蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜后，经5%的BSA封闭1 h后分别加入相应的一抗：Caspase-3(1∶500)、Caspase-9(1∶500)，4 ℃下过夜孵育。然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后，加入发光液后，于凝胶成像仪进行曝光拍照，并统计灰度值，计算相对表达量。

1.6 ELISA检测 收集各组待测大鼠血清，然后按照ELISA试剂盒说明书步骤检测IL-18、IL-1β含量。首先，样品加入反应孔后于37 ℃孵育45 min，洗涤液洗涤4次后，再加入生物素标记的抗体，于37 ℃反应30 min，洗涤后再加链霉亲和素-HRP并混匀，于37 ℃反应30 min。加入显色剂避光显色15 min，最后添加终止液终止反应，450 nm处检测吸光值。

1.7 免疫组织化学 用PBS将各组大鼠肾脏组织清洗8次，去掉坏死组织及血凝块后，用4%多聚甲醛在4 ℃下固定24 h。再用PBS清洗3次，30%、50%、70%的酒精依次脱水10 min，去除酒精脱水机中脱水。然后进行石蜡包埋切片。石蜡切片经过脱蜡再水化后用1%的triton-100处理15 min，再用3%的H2O2处理15 min。用5%的羊血清封闭30 min后依次孵育一抗(4 ℃，过夜)和二抗(37 ℃，30 min)。最后进行染色封片。

1.8 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，两两比较用独立t检验。P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠尿蛋白水平的影响 由图1可见，Control组、SA组、STZ组、STZ+SA组24 h尿蛋白水平分别为(8.3±3.2)、(6.9±2.1)、(53.1±8.5)、(24.8±4.1) mg/24 h，其中，STZ组高于对照组、STZ+SA组(P<0.01)。

图1 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠尿蛋白水平的影响

2.2 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠血清肌酸酐水平的影响 Control组、SA组、STZ组、STZ+SA组大鼠血清肌酸酐水平分别为(0.55±0.06)、(0.49±0.09)、(1.07±0.12)、(0.67±0.11) mg/dl。结果显示，STZ组大鼠血清肌酸酐水平高于对照组、STZ+SA组(P<0.01)。见图2。

2.3 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠尿素氮水平的影响 Control组、SA组、STZ组、STZ+SA组大鼠尿素氮水平分别为(12±4.1)、(8.7±3.2)、(32.4±5.3)、(17.6±3.6) mg/dl。结果显示，STZ组大鼠尿素氮水平高于对照组、STZ+SA组(P<0.01)。见图3。

图2 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠血清肌酸酐水平的影响

图3 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠尿素氮水平的影响

2.4 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响 Control组、SA组、STZ组、STZ+SA组凋亡率分别为7.8%±3.2%、7.5%±2.1%、53.4%±8.9%、16.8%±4.1%。如图4、图5所示，STZ大鼠肾脏组织凋亡细胞数多于Control组(P<0.01)。与STZ相比，STZ+SA组肾脏组织凋亡细胞数减少(P<0.01)。由此可见，番泻苷A可减弱糖尿病肾病大鼠肾脏组织细胞凋亡。

图5 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响

2.5 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠细胞凋亡相关蛋白表达的影响 见表1、图6。结果显示，STZ组大鼠Caspase-3和Caspase-9的表达强于Control组、STZ+SA组(P<0.01)。

表1 蛋白印记检测细胞凋亡相关蛋白表达

注：**与STZ组比较，P<0.01

图6 蛋白印记检测大鼠细胞凋亡相关蛋白表达

2.6 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠炎症反应的影响 见表2、图7。结果显示，STZ组大鼠IL-1β、IL-18水平高于Control组、STZ+SA组(P<0.01)。

2.7 番泻苷A对糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化的影响 采用免疫组化染色检测纤维化标记蛋白Fibronectin表达， 结果显示， Control组、SA组、STZ组、STZ+SA组大鼠Fibronectin表达水平分别为15.2%±2.6%、21.3%±1.9%、86.4%±3.2%、34.5%±4.1%。如图8、图9所示，STZ大鼠肾脏组织中Fibronectin表达高于Control组(P<0.01)。番泻苷A处理组大鼠肾脏组织中Fibronectin表达低于STZ组(P<0.01)。以上结果说明，番泻苷A可减轻糖尿病肾病大鼠肾纤维化。

表2 ELISA检测炎症因子水平(pg/ml)

注：**与STZ组比较，P<0.01

图7 ELISA检测大鼠炎症因子水平

图8 免疫组化染色检测大鼠纤维化标记蛋白Fibronectin表达

3 讨论

目前，糖尿病肾病的治疗策略是控制高血糖和高血压，以及抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统[9-10]。研究表明，草药用于各类疾病的预防及治疗受到了广泛关注[11]。研究表明，在氯化汞诱导的急性肾衰竭大鼠中，大黄的蒽醌类提取物可降低血清肌酸酐和尿素氮水平[12]。Chen等[13]发现，大黄酸可抑制IgA肾病大鼠尿蛋白水平升高。在腺嘌呤诱导的肾病小鼠中，大黄酸可降低血清肌酸酐和尿素氮水平[14]。本研究结果显示，番泻苷A可降低STZ诱导的糖尿病肾病大鼠尿蛋白、血清肌酸酐和尿素氮水平。

图9 各组大鼠纤维化标记蛋白Fibronectin表达

细胞凋亡在各类疾病中起着重要作用，许多大黄的蒽醌类化合物具有调控细胞凋亡的功效。Lian等[15]发现，黄芪多糖联合大黄酸处理可抑制慢性肾衰竭大鼠 IRE1、CHOP表达，降低肾小管细胞凋亡。在缺血/再灌注小鼠中，大黄酚可减弱CHOP、Caspase-12表达升高，降低神经元细胞凋亡[16]。同时，大黄素可抑制顺铂诱导的肾病大鼠细胞凋亡[17]。本研究显示，番泻苷A可减弱STZ诱导的糖尿病肾病大鼠Caspase-3、Caspase-9表达。

研究表明，大黄的蒽醌类化合物在抗炎方面发挥了积极作用。Meng等[18]研究表明，在高尿酸肾病小鼠中，大黄酸可抑制IL-1β、PGE2、TNF-α水平升高，降低炎症反应。在糖尿病肾病大鼠中，大黄素可减弱IL-6和TNF-α水平的上升，抑制炎症反应[19]。有研究发现，大黄酸可降低5/6肾脏切除大鼠中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的释放，减轻炎症反应[20]。本研究结果显示，番泻苷A可降低STZ诱导的糖尿病肾病大鼠IL-1β、IL-18水平，抑制炎症反应。

大黄的蒽醌类化合物还具有改善肾纤维化的功效。Zhang等[21]研究显示，在慢性肾衰竭大鼠中，大黄提取物可抑制Fibronectin表达，改善肾纤维化。有报道，大黄酸可减轻单侧输尿管阻塞引起的肾纤维化[22]；大黄素可减弱STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏组织Fibronectin的分泌[23]。本研究结果显示，番泻苷A可降低STZ诱导的糖尿病肾病大鼠肾脏组织Fibronectin的表达。

本研究显示，在STZ诱导的糖尿病肾病大鼠中，番泻苷A可降低尿蛋白、血清肌酸酐和尿素氮水平，减弱Caspase-3、Caspase-9表达，降低IL-1β、IL-18水平，减弱Fibronectin表达，表明番泻苷A可减轻STZ诱导的糖尿病肾病大鼠肾损伤及炎症反应。下一步研究方向是番泻苷A影响STZ诱导的糖尿病肾病大鼠肾损伤和炎症反应的分子机制，为开发新的糖尿病肾病治疗药物奠定基础。