追风透骨胶囊对脊髓损伤模型大鼠脊髓神经细胞凋亡的影响及其机制研究

黄旭阳，王舒涵，韩 冬，李润辉

0 引言

脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是严重的中枢神经系统创伤性疾病之一。2011年全国部分省市调查结果显示，SCI发病率为23.7～60.6/100 000[1]，其主要原因为机动车事故(40.0%)或高空坠落(37.8%)[2]。SCI后常导致损伤组织的细胞凋亡等病理生理反应发生紊乱，从而严重影响脊髓相应节段神经束传导功能，进而导致患者发生肢体麻木与瘫痪[3-5]。因此，寻找一条有效的途径来降低SCI后细胞凋亡水平至关重要。Wnt信号通路与多种神经系统中发生的病理生理过程密切相关，如神经退行性病变、神经炎症反应及神经细胞凋亡等。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路可以抑制由脊髓损伤引起的神经元凋亡，进而促进运动神经元功能恢复[6]。追风透骨胶囊(Zhuifengtougu capsule，ZFTG)是由川乌总碱、天麻等24种药材制成的中成药，主要有祛风湿、通经络、镇痛祛寒等作用。临床上主要应用于神经麻痹、手足麻痹、风寒湿痹、四肢痹痛等症状[7-8]。近年研究发现，追风透骨胶囊所含有的川乌总碱、蚯蚓素、天麻素、川芎嗪等多种活性物质可能与抗神经损伤有密切关系[7,9-10]。前期研究发现，ZFTG可以有效地激活Wnt/β-cantein信号通路并减少细胞凋亡。因此，本实验拟探讨追风透骨胶囊对SCI模型大鼠脊髓运动神经元的保护作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠45只，8～10周龄，体重240～260 g。由沈阳医学院动物实验中心提供，实验动物生产许可证编号：SCXK(辽)2014-0004。

1.1.2 药物 将追风透骨胶囊(湖南天地恒一)内粉末研碎至于PBS中，加热并超声波震荡溶解，溶解后4 ℃保存。

1.1.3 主要试剂与仪器 主要试剂：β-catenin抗体(Abcam公司)，LRP-6抗体(Abcam公司)，active Caspase-3抗体(Cell signaling公司)等。主要仪器：Biorad双向电泳仪、通用电泳仪、大型水平、小型垂直电泳槽，Leica组织自动包埋机、冰冻切片机，Nanodrop ND2000检测仪和Tecan酶标仪等。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模及给药 大鼠适应性饲养5 d。采用随机数字表法将大鼠分为Sham组(假手术组)、Vehicle组(脊髓损伤组)、ZFTG组(治疗组，20 mg/kg，浓度由人体用药浓度换算)，每组15只。实验大鼠用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，进行备皮-消毒-铺单工作。Sham组只切开脊髓最高点的皮肤，钝性分离组织并破坏椎板(相当于T10节段)，但是不损伤脊髓组织。Vehicle组在Sham组的基础上，应用经典的Allen′s法(用脊髓打击器打击脊髓)制造SCI模型后，注射与ZFTG组相应剂量的PBS溶液。ZFTG组在Vehicle组的基础上，腹腔注射已经配制好的追风透骨胶囊溶液。术后饲养于SPF级鼠房，每天喂食喂水并排尿2次。在饲养过程中，Sham组死亡1只，Vehicle组死亡3只，ZFTG组死亡1只。

1.2.2 大鼠行为学实验(BBB评分) 本实验采用Basso、Beattie、Bresnahan locomotor rating scale(BBB评分)评价大鼠SCI后运动功能恢复情况。分别在第2部分实验术后第1、3、7、14、28天进行评分。简单来说，BBB评分是观察SCI后动物的踝、臀、膝关节，躯干运动及其协调情况，分数为0分(完全瘫痪)～21分(脊髓未受损伤)。所有BBB评分的工作均由4名有经验的实验者用双盲的实验方法共同完成。

1.2.3 组织准备与尼式染色 术后第7天，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，应用生理盐水与4%多聚甲醛(PFA)依次灌流。灌流成功后取脊髓(T8～L2)，放置于4%多聚甲醛中固定。2 d后，用冰冻切片机切片，每张厚度20 μm(采用单盲法测量40张切片)，切好后贴在载玻片上，并放入-20 ℃ 冰箱保存，之后在室温下晾干(30 min)。将切片放入氯仿乙醇(1∶1)中过夜，次日取出后三蒸水浸泡，洗3遍，放入37 ℃焦油紫中浸泡40 s，放入三蒸水，洗1遍，之后依次放入95%乙醇、无水乙醇、二甲苯溶液，最后取出后用中性树胶封片。静置1 d后光学显微镜照相检测。

1.2.4 Western blot检测 术后7 d，按上述方式，在冰浴条件下取脊髓组织提蛋白并用BCA法制样。准备好样品后上样，电泳后转膜(湿转)、封闭，最后加一抗4 ℃过夜，第2天加相应的二抗。其中一抗分别是β-catenin(1∶1 000)、LRP-6(1∶1 000)、active Caspase-3(1∶800)、β-actin(1∶1 000)。随后滴加适量的ECL显色液上机检测，最后用Image J软件检测条带吸光度(A)值。

2 结果

2.1 追风透骨胶囊对SCI模型大鼠运动功能的影响 术后分别在第1、3、7、14、28天测定BBB评分。Sham组评分基本稳定在21分，ZFTG组与Vehicle组曲线均呈上升趋势。但是与Vehicle组比较，ZFTG组的分数分别在损伤后第7、14天升高(P<0.05)，第28天分数明显升高(P<0.01)，表明追风透骨胶囊与SCI模型大鼠的相关运动功能恢复有密切联系。见图1。

2.2 追风透骨胶囊对SCI模型大鼠脊髓前角运动神经元含量的影响 术后第7天，对切片进行尼式染色(神经元特异性染色)。结果显示，大鼠脊髓前角运动神经元计数中，与Vehicle组比较，ZFTG组数量明显升高(P<0.05)，表明追风透骨胶囊可以维持SCI模型大鼠的脊髓前角运动神经元的含量。见图2。

图1 各组大鼠的行为学检测

2.3 追风透骨胶囊对SCI模型大鼠脊髓组织中β-catenin、LRP-6、active Caspase-3蛋白含量的影响 术后7 d，提取不同分组中大鼠的脊髓蛋白并制样，进行Western blot实验检测上述蛋白的抗体。结果显示，与Vehicle组相比，ZFTG组β-catenin蛋白特异性升高(P<0.01)，LRP-6蛋白表达被明显激活(P<0.01)，提示β-catenin信号通路被激活。active Caspase-3蛋白表达被明显抑制(P<0.01)，提示组织凋亡水平下降。见图3。

3 讨论

SCI包括原发性和继发性损伤2个病理过程，其中继发性损伤在运动神经功能恢复过程中起重要作用，损伤多由炎症反应、氧化应激、凋亡、细胞自噬、组织水肿与瘢痕形成等因素引起[11-14]，而神经细胞凋亡水平的调控影响SCI后神经功能的恢复进程及结局[15]。但是，目前SCI后神经修复的具体分子机制尚不明确，因此，寻找SCI后神经功能恢复的具体分子机制以及阐述炎症与凋亡等特异性病理生理变化在SCI后神经功能修复过程中的作用是SCI领域的一项重大课题。在当今医学发展中，中医中药发挥着越来越重要的作用，已经有文献报道了追风透骨胶囊的有效成分中草乌总碱、川乌总碱、蚯蚓素、天麻苷元等(12种)对抗炎有独特的疗效。此外，川芎嗪、天麻素等有效成分可以有效缓解神经损伤症状(如神经麻痹、肢体麻木等)[7-10]。前期试验结果显示，ZFTG可以有效调节组织凋亡水平，并且可以缓解神经损伤，然而其具体机制不清。

本课题首次揭示ZFTG调控SCI后凋亡水平，但ZFTG治疗大鼠SCI方面研究较少，缺少可以直接借鉴的药物浓度，因此，需要寻找一个有效的药物浓度。我们根据ZFTG人体应用剂量估算出实验浓度，并进行相关验证。研究表明，动物行为学实验(BBB评分)可以宏观判断一种干预手段是否切实有效，特别是在神经损伤与行为认知方面[16]，并且本研究中BBB评分结果显示ZFTG组评分明显优于Vehicle组，充分验证了此浓度下ZFTG可有效促进SCI大鼠下肢主要关节(髋、膝、踝)运动功能及其协调性的恢复。由于其行为学评分在第7天开始出现明显差异，所以，本课题应用术后第7天大鼠进行机制探究。脊髓组织中负责传递信号的细胞是神经元，因此，神经元的含量与功能是否正常可以影响脊髓相应节段中神经的传导功能。因此，神经元含量可以粗略反映出神经传导是否正常[17]。本研究结果显示，在神经元特异性尼式染色的结果中，ZFTG组脊髓前角运动神经元的数量明显多于Vehicle组，说明追风透骨胶囊可以增加脊髓内神经元的含量。因为脊髓前角运动神经元主要支配躯体运动，所以追风透骨胶囊可能与大鼠运动功能的恢复有密切联系。

图2 追风透骨胶囊对脊髓神经元含量的影响

图3 追风透骨胶囊对炎症反应及细胞凋亡水平的影响及其分子机制

注：A.Western blot检测追风透骨胶囊对炎症反应和细胞凋亡水平的影响，B.β-catenin/β-actin的定量分析，C.LRP-6/β-actin的定量分析,D.active Caspase-3/β-actin的定量分析。与Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01

研究表明，神经损伤恢复过程中会出现炎症反应、细胞凋亡、细胞自噬等病理生理反应，特别是在中枢神经系统中，神经元的凋亡水平可以直接决定相应脊髓节段神经通路是否可以正常传导[11-14]。Wnt/β-catenin信号通路在中枢神经系统中发挥重要的抗凋亡作用，并且此通路激活后，相关的关键因子LRP-6也会被特异性激活[6]。本研究表明，术后第7天，ZFTG组的active Caspase-3蛋白表达水平被明显抑制，说明追风透骨胶囊可以有效减低SCI损伤组织中细胞凋亡水平。同时本实验结果显示，ZFTG组β-catenin、LRP-6蛋白表达水平明显升高，说明追风透骨胶囊通过激活Wnt/β-catenin信号通路降低细胞凋亡水平。

本研究采用追风透骨胶囊干预SCI模型大鼠，观察大鼠运动功能的恢复及其分子机制。结果显示，ZFTG可以增加SCI大鼠模型的脊髓前角运动神经元的数量，这可能与大鼠运动功能的恢复有关。同时，追风透骨胶囊可以明显降低损伤脊髓中细胞凋亡水平，这可能与ZFTG激活Wnt/β-catenin信号通路有关。综上所述，ZFTG可以抑制SCI引起的细胞凋亡，并可增加脊髓前角运动神经元的数量，进而促进广大脊髓损伤患者损伤神经元的修复，并提高其生活质量水平。