星点设计-效应面法优化清石颗粒醇提工艺

崔亚玲，赵庆春，马宏达，岳 晶，胡 北，李 昕

0 引言

清石颗粒主要由海金沙、石韦、厚朴、茯苓、萹蓄、茵陈、泽泻、瞿麦、白茅根、大腹皮、黄芪、乌药、炙甘草提取精制而成，具有清热凉血、利湿通淋、排石止痛的功效，主要用于治疗泌尿系结石，其疗效显著，在我院泌尿外科临床应用多年。本研究对厚朴、乌药、泽泻选用乙醇提取，采用单因素考察和星点设计效应面法，以厚朴酚、和厚朴酚的含量及出膏率为综合评价指标，优选清石颗粒醇提工艺，为其工业化大生产制备无糖型颗粒制剂提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(LC-19AD型，Japan Shimadzu)；色谱工作站N2000(浙江大学智能信息工程研究所)；KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-D4恒温水浴锅(金坛市双捷试验仪器厂)；电子分析天平AUW120D(北京岛津公司)。

1.2 试药 厚朴酚对照品(批号：110729-200412)、和厚朴酚对照品(批号：110730-201313)均购于中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯，Fisher公司)；甲醇(分析纯，天津博迪化工股份有限公司)；乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；95%乙醇(分析纯，盘锦天源药业有限公司)；重蒸水(沈阳军区总医院自制)；厚朴(批号：20131208)、乌药(批号：20140405)、泽泻(批号：20131209)，安国市童铃药材有限公司。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 Welchrom C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)为色谱柱；以甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)为流动相[1]。

2.1.2 对照品溶液的配制 精密称取和厚朴酚及厚朴酚对照品，加甲醇溶解并制成含厚朴酚、和厚朴酚各20 μg/ml的混合溶液，即对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品稠膏约0.08 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇100 ml，密塞称重，超声处理20 min，放冷恢复至室温后再次称重，减少的重量加入甲醇补足，摇晃均匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性(除厚朴)样品溶液的制备 按制剂处方配比称取除厚朴外的其他12味药材，按处方工艺制备成阴性样品，按“2.1.3”项供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。

2.1.5 专属性试验 精密吸取阴性(除厚朴)样品溶液，厚朴酚、和厚朴酚混合对照品溶液和供试品溶液各20 μl，进行色谱分析，结果表明，阴性样品不干扰厚朴酚、和厚朴酚的测定，厚朴酚、和厚朴酚与其他成分或杂质分离良好，结果见图1。

图1 厚朴酚及和厚朴酚专属性图谱

2.1.6 标准曲线及线性关系考察 精密吸取浓度为2.5、5、10、20、40、80 μg/ml的厚朴酚、和厚朴酚混合对照品溶液各20 μl，进行色谱分析，横坐标为对照品浓度(μg/ml)，纵坐标为峰面积值，求得回归方程：Y厚朴酚=20 162 X+12 648，r=0.999 9；Y和厚朴酚=20 962 X+13 270，r=0.999 9。结果表明，厚朴酚、和厚朴酚在2.5～80 μg/ml范围内均与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.7 精密度试验 精密吸取20 μl浓度为20 μg/ml的厚朴酚、和厚朴酚对照品溶液，连续进样6次，测得厚朴酚峰面积及和厚朴酚峰面积的RSD分别为0.64%、0.61%(n=6)，表明该仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液20 μl，按“2.1.1”项色谱条件分析，分别在制备后0、2、4、6、8、10、12 h进行色谱分析，测得厚朴酚峰、和厚朴酚峰面积的RSD均为2.52%(n=6)，说明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.9 重复性、回收率试验 按相关方法操作，重复性试验结果表明，样品中厚朴酚及和厚朴酚平均含量分别为20.85、11.06 mg/g，RSD分别为2.64%、2.88%(n=6)；厚朴酚的平均回收率为96.9%，RSD为2.38%(n=6)，和厚朴酚的平均回收率为100.1%，RSD为2.44%(n=6)，均符合要求。

2.2 星点设计-效应面法试验

2.2.1 提取次数的选择 采用乙醇回流法制备厚朴、乌药、泽泻的提取物稠膏，乙醇浓度、溶剂用量、提取时间和提取次数是影响该法提取的主要因素。由于提取次数是非连续变量，不适用于星点设计分析，故对提取次数进行单因素考察[2-3]。

按处方取厚朴、乌药、泽泻药材3份，分别置于圆底烧瓶中，加入10倍量80%乙醇回流提取1 h，分别提取1、2、3次，滤过，取滤液，加热浓缩至恒重，制得稠膏，按“2.1.3”项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，并进行色谱分析，厚朴酚、和厚朴酚含量测定结果见表1。结果表明，提取次数为1次时，出膏率最低，厚朴酚、和厚朴酚含量最高，故将提取次数定为1次。

表1 不同提取次数对出膏率及厚朴酚、和厚朴酚含量的影响(n=3)

2.2.2 星点试验设计 根据星点设计原理，选取乙醇浓度、提取时间、溶剂用量为考察因素，每因素设5个水平，用代码值-α、-1、0、1、α(α=1.682)表示，因素水平表见表2。分别按星点设计的因素安排试验，以出膏率、厚朴酚及和厚朴酚总含量为评价指标，并将这两个指标用Hassan方法标为0～1之间的“归一值”，以各指标“归一值”计算几何平均数，得总评“归一值”(总评OD值)[4]。试验安排见表3。

表2 星点设计因素与水平

由表4方差分析结果可知，二次多项式方程的P值<0.001，相关系数R2=0.940 2，说明方程拟合度良好，失拟项P=0.60>0.05，表明该模型能够较好且误差较小地反映响应值的变化。且该模型中，X1(乙醇浓度)、X2(提取时间)对醇提工艺的提取得率有显著影响(P<0.01)，综上所述，此模型具有显著的拟合度和预测性，因此，该模型可用于对清石颗粒的醇提工艺进行分析和预测。

2.2.4 效应面优化与预测 根据优化后的二项式拟合方程，在保持1个因素编码值为0时，应用Design-expert 8.0.6软件绘制其他2个因素与响应值关系的三维效应面图，结果见图2～图4。基于上述拟合所建立的数学模型，得到最佳提取条件为7.22倍量73.92%乙醇回流提取84.32 min。结合实际生产，本试验最终选取的工艺条件为7倍量75%乙醇回流提取90 min。

表3 醇提工艺星点设计试验安排及结果

注：15～19号为重复性试验

表4 二次多项回归方程方差分析结果

2.2.5 验证试验 按处方配比称取药材(n=3)，依据上述预测的最佳提取条件进行验证试验。结果其总评OD值分别为0.898 7、0.883 2、0.911 2，而预测总评OD值为0.905 8，偏差率为-0.00 894%，说明所建立的数学模型具有良好的预测性，可用于清石颗粒醇提工艺的优化。

3 讨论

3.1 在厚朴酚、和厚朴酚的含量测定方法学建立中，笔者对流动相甲醇-水(78∶22)、甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)、甲醇-水-1%冰醋酸溶液(75∶25)进行了考察[5-6]。结果显示，以甲醇-水(78∶22)为流动相时，峰形不佳，且阴性有干扰。为改善峰形及分离效果，在2010版《中国药典》一部厚朴药材的含量测定项下色谱条件的基础上，笔者调节甲醇、水的比例，并加入低比例醋酸调节流动相的离子强度。结果表明，以甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)、甲醇-1%冰醋酸溶液(75∶25)为流动相时，峰形理想，且阴性无干扰。为免色谱柱键合相受损坏而降低柱效，故选用甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)为流动相。

3.2 目前，相对于国内应用较为成熟的均匀设计和正交试验设计方法，星点设计-效应面优化法能更好地解决试验精度不够、条件优选不能灵敏地考察各因素间的交互作用等问题，且因其具有可旋转性及均匀精度性，使其作为一种新型的试验设计方法，在药学领域发挥显著成效[7-8]。因此，本研究选用星点设计效应面法优化清石颗粒醇提工艺，以乙醇浓度、提取时间、溶剂用量为考察因素，厚朴酚、和厚朴酚的含量及出膏率为综合评价指标，并采用归一化几何平均数法对数据进行处理，消除了因各评价指标单位或量纲不同所带来的影响[9]，利用软件建立数学模型，绘制三维效应曲面关系图，预测并验证最佳工艺条件，为其工业化生产提供依据。

图2 乙醇浓度和提取时间对醇提工艺影响的三维效应曲面图

图3 乙醇浓度和溶剂用量对醇提工艺影响的三维效应曲面图

图4 提取时间和溶剂用量对醇提工艺影响的三维效应曲面图