摘叶处理对黑穗醋栗叶片和果实AsA-GSH循环代谢的影响

霍俊伟，刘庆帅，秦 栋，孙小娟，李芳晓

（东北农业大学园艺园林学院，农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，寒地小浆果开发利用国家地方联合工程研究中心，哈尔滨 150030）

抗坏血酸（Ascorbic acid，AsA）是从食物中摄取的小分子物质，具有极强抗氧化性，具有防治坏血病，参与造血、促进胶原蛋白合成，治疗哮喘、抗肿瘤等作用[1-2]。其在植物内可清除自由基，作为某些还原酶辅因子参与还原反应，在调节植物生长、诱导开花、延缓衰老、促进细胞分裂、碳氮代谢、信号转导和传递等生理调控过程具有重要作用[3-4]。L-半乳糖途径是大多数植物抗坏血酸生物合成主要途径[5-6]，已在苹果[7]、葡萄[8]、刺梨[9]、番茄[10]和猕猴桃[11]等园艺作物上得到验证。抗坏血酸-谷胱甘肽（Ascorbate-glutathione，AsA-GSH）循环是AsA再生途径之一，其在黑穗醋栗果实AsA积累中作用已被证实[12]。

黑穗醋栗（Ribes nigrum L.）属虎耳草科（Saxifragaceae）茶藨子属落叶丛生灌木[13]，果实为黑色浆果，有光泽，近球形，味酸甜，清香，营养价值丰富，富含高水平AsA，含量高达200～400 mg·100 g-1FW[14]，是重要AsA植物源。

黑穗醋栗不同品种果实AsA含量不同，差异明显，AsA含量与抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性呈正相关，果实AsA含量较高品种，叶片AsA含量也高，果实坐果后叶片AsA含量明显下降[15]。

研究表明，植物叶片等源器官具备完整AsA合成途径，由于AsA长距离运输理论的提出，使植物库器官AsA形成机制复杂化，尤其对葡萄、苹果、梨、越橘等低AsA含量水果的AsA合成能力，其组织间差异是研究果实AsA积累机制基础，也是提高果实AsA水平前提[16]。14C喂饲拟南芥和紫花苜蓿后，发现AsA可从叶片经韧皮部向芽、花和根长距离运输[17]；AsA转运参与刺梨果实AsA积累，但刺梨除果实外，其他各组织器官DHA含量均较高，叶片AsA和DHA浓度相对其他叶柄和枝条更高，刺梨可能以叶片为合成源头，将氧化产物长距离运输到果实[18]。番茄同位素标记试验表明，番茄植株AsA从叶片输出后大部分积累在绿色未成熟果实中，而在成熟果实中未积累[19]。可见长距离运输积累AsA途径，不仅在器官和组织间存在差异，也因物种不同而不同。

为进一步研究黑穗醋栗果实与叶片AsA含量关系，Qin等在果实开始坐果时，摘去50%果实（总坐果量50%），探讨摘果处理对AsA含量及AsA-GSH循环影响，结果表明，摘果处理显著增加果实AsA含量，但叶片AsA含量减少；而摘果处理组枝条果实AsA含量增加与减少与自身AsA再生循环无联系，可能受枝条总叶片AsA含量影响[12]。叶片减少是否影响果实AsA含量及AsAGSH代谢循环，尚未见详细报道。

为全面揭示黑穗醋栗果实AsA合成积累机理，本试验作摘叶处理，探讨摘叶处理对叶片和果实AsA含量及AsA-GSH代谢循环影响，为选育高含量AsA加工专用新品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试材为8年生、长势相对一致但果实AsA含量差异显著的3个栽培品种：亚德、布劳德和利桑佳，其果实和叶片AsA含量见表1。试材定植于东北农业大学黑穗醋栗种质资源圃内，管理水平中等。

1.2 摘叶处理

黑穗醋栗果实开始坐果时（5月初），每个品种单株选取生长势相近、结果数及叶片数相近两个植株，对其中1个植株摘叶处理，去除其50%叶片，另一植株作对照，每个品种处理30个单株，每次采样后保证处理枝条叶片始终是对照枝条总叶片数50%。每隔7 d采样1次，直至果实成熟，共采样8次。每次取样后，当天或第2天测量部分新鲜果实和叶片样品AsA含量，其余果实和叶片经液氮冷冻后，贮存于-80℃冰箱，用于相关酶活性测定。

1.3 测定方法

AsA含量测定采用高效液相色谱法[15]。TAsA、DHA含量测定参考文献[20]。APX、MDHAR、DHAR、GR活性测定分别参考文献[21-22]，GSH和GSSG含量测定参考文献[23]。以上测定均重复3次。

1.4 统计分析

运用Excel 2003处理数据并绘图，DPS 9.5软件作显著性检验分析。

数据处理及结果分析中，未摘叶处理（对照组）叶片、未摘叶处理（对照组）果实、摘叶处理（处理组）叶片和摘叶处理（处理组）果实分别记为CL、CF、TL和TF。

表1 黑穗醋栗品种及AsA含量（±标准差）Table 1 Black currant varieties and AsA content(±standard deviation)

2 结果与分析

2.1 摘叶处理对黑穗醋栗叶片及果实AsA含量的影响

由图1可知，高AsA含量品种亚德和低AsA含量品种利桑佳，其叶片和果实AsA含量变化趋势相同，随果实发育而增加，第3周达最大值，亚德、布劳德和利桑佳每100 g鲜重果实AsA含量分别为424.03、256.97和274.96 mg；叶片AsA含量分别为122.36、81.07和70.04 mg；由于果实膨大而下降，果实着色期和成熟期（第5～8周）趋于稳定。

与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理明显增加处理组叶片AsA含量，且差异极显著（p＜0.01），第3周，亚德摘叶处理组叶片AsA含量是对照1.31倍；摘叶处理对果实AsA含量影响与叶片相反，摘叶处理组中，果实AsA含量明显低于对照，差异极显著（p＜0.01）。第3周，利桑佳果实AsA含量是对照0.87倍，可能是随叶片相对减少，果实AsA含量相对减少，反之促进叶片AsA合成。

图1 3个黑穗醋栗品种摘叶处理与对照组抗坏血酸含量比较Fig.1 Comparison of ascorbic acid content between defoliation and control in three black currant varieties

2.2 摘叶处理对黑穗醋栗叶片及果实GSH含量及GSH/GSSG的影响

果实发育期内，摘叶处理对叶片及果实GSH含量无显著影响（以布劳德为例）。坐果后第1周，果实GSH含量较低，至第3周略有上升，后缓慢下降，幅度不大（见图2A）。摘叶处理后，对照组与处理组果实GSH含量无显著差异（P＞0.05），表明叶片相对减少，对果实GSH含量无显著影响。

3个品种叶片GSH含量试验周期呈先升后降趋势（以布劳德为例）。坐果后第1周含量最低（15.93 mg·100 g-1），后迅速上升，第3周达峰值（34.02 mg·100 g-1），是第1周2.13倍，随后由于果实膨大而有所下降，果实着色期和成熟期（第5～8周）趋于平稳，与果实AsA含量变化趋势相似。随果实发育，果实GSH/GSSG呈缓慢上升趋势（见图2B），而叶片GSH/GSSG变化幅度较大，但始终低于同期果实（见图2B）。叶片GSH/GSSG变化趋势与叶片AsA含量变化同步，坐果后1周比值最低，随果实发育，呈先升后降趋势，第3周达峰值，是第1周4.7倍，之后逐渐下降，第8周下降为1.9，与第1周GSH/GSSG相差小。与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理后处理组叶片GSH/GSSG增加，第4周相差最大，差值为0.5；但摘叶处理对果实GSH/GSSG影响小。表明叶片相对减少影响叶片AsA-GSH循环。

图2 摘叶处理布劳德GSH含量及GSH/GSSGFig.2 GSH content and ratio of GSH/GSSG in Brodtrop after defoliation

2.3 摘叶处理对黑穗醋栗叶片及果实AsA-GSH循环相关酶活性影响

植株生长发育过程中，3个品种APX酶活性变化趋势相同，但每个品种叶片和果实酶活性变化存在差异（见图3）。

果实中，APX活性初期活性较高，之后随果实发育，呈下降趋势，其中1～3周下降幅度较大，4～8周酶活性变化较小，与果实AsA含量变化趋势相反。叶片中，酶活性1～2周下降，随后迅速升至第3周达峰值，亚德、布劳德和利桑佳叶片APX活性分别为39.35、36.37和33.57 U·g-1；之后由于果实膨大下降，但在果实成熟期（第7～8周）略升。

与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理增加处理组果实APX活性，第3周，亚德品种处理组果实APX活性是对照组1.12倍；摘叶处理对叶片APX活性影响与果实相反，处理组中，叶片酶活性低于对照，第3周，利桑佳品种叶片APX活性是对照0.93倍。可能因叶片减少，导致叶片APX活性降低，但反之促进果实APX活性升高。

3个品种DHAR活性高低与AsA含量呈正比，亚德和利桑佳，其DHAR活性变化趋势相同（见图4），均随果实发育呈先升后降趋势，但与AsA含量变化不同，其酶活性在坐果后第4周达峰值（滞后1周），亚德、布劳德和利桑佳果实DHAR活性分别为46.71、42.68和34.58 U·g-1；叶片DHAR活性分别为56.22、53.79和49.48 U·g-1；之后由于果实膨大下降，果实成熟期（第7～8周）趋于稳定。

与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理对处理组果实DHAR活性无显著影响；而叶片中，处理组叶片DHAR活性始终高于同期对照组叶片酶活性，且AsA越高，差异越显著（p＜0.05）。由此可知，摘叶处理影响叶片DHAR活性，但对果实DHAR活性影响小。

图3 3个黑穗醋栗品种摘叶处理与对照APX活性比较Fig.3 Comparison of APX activity between defoliation and control in three black currant varieties

图4 3个黑穗醋栗品种摘叶处理与对照DHAR活性比较Fig.4 Comparison of DHAR activity between defoliation and control in three black currant varieties

3个品种MDHAR活性变化趋势相同（见图5），以布劳德为例，果实和叶片MDHAR活性均呈先升后降趋势，第4周达峰值，布劳德果实和叶片MDHAR活性分别为19.64和24.37 U·g-1。与未摘叶处理（对照）相比，处理组果实MDHAR活性降低，而处理组叶片MDHAR活性升高。

随果实发育，3个品种GR活性变化趋势相似，以布劳德为例。自坐果后，GR活性随果实发育呈下降趋势（见图6），1～3周下降幅度较大，4～8周酶活性变化较小，趋于稳定，与果实APX活性变化趋势相同。而叶片中，酶活性1～3周迅速上升至第3周达峰值（26.03 U·g-1），随后由于果实膨大而有所下降，但在果实着色期和成熟期（第5～8周）趋于稳定。

与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理后处理组果实GR活性降低，但差异不显著（P＞0.05）；而叶片中，摘叶处理明显增加处理组第3周叶片GR活性，且差异显著（p＜0.05），第3周时处理组叶片GR活性是对照组1.1倍，而其他坐果时期差异不显著。

图5 布劳德摘叶处理与对照MDHAR活性比较Fig.5 Comparison of MDHAR activity between defoliation and control in Brodtrop

图6 布劳德摘叶处理与对照组GR活性比较Fig.6 Comparison of GR activity between defoliation and control in Brodtrup

3 讨论与结论

AsA是植物体内一种非酶抗氧化剂和氧化还原物质，在清除活性氧自由基及抗氧化方面具有重要作用。目前，猕猴桃[24]、刺梨[25]、葡萄[26]等园艺作物AsA生物合成和代谢途径已有深入研究，探讨高等植物抗坏血酸含量差异主要影响因素[27]。高等植物AsA生物合成和代谢途径，特别是明确AsA生物合成L-半乳糖途径和AsA-GSH循环再生途径后，通过研究AsA含量与AsA-GSH循环再生途径相关酶间关系，可为选育高含量AsA黑穗醋栗新品种提供理论依据。

本研究以AsA含量差异较大3个品种亚德、布劳德和利桑佳为试材，摘叶处理并测定3个品种相关酶活性，结果表明，3个品种间AsA含量变化趋势相似，均随坐果时间增加呈先升后降趋势，果实AsA迅速积累期主要在坐果第2～3周，第3周达最大值，与果实膨大期吻合，也可能与AsA参与果实初期细胞分裂有关，之后随果实膨大AsA含量逐渐下降，与苹果[28]、猕猴桃[24]AsA积累特点基本一致。摘叶处理后，处理组叶片AsA含量明显增加，而果实AsA含量明显低于对照，可能是随叶片相对减少，果实AsA含量相对减少，反之促进叶片AsA合成。

越橘[29]、草莓[30]、甜樱桃[31]、猕猴桃[32]、苹果[33]等研究表明，AsA含量与DHAR和MDHAR活性密切相关。本试验结果表明，与AsA-GSH循环再生途径相关的DHAR、MDHAR和GR酶活性先增后减，摘叶处理后叶片DHAR、MDHAR和GR活性增加，而果实酶活性降低，与AsA含量变化相似。3个品种MDHAR、GR活性变化趋势相似，但不同品种MDHAR和GR活性差异较大。APX活性变化与AsA含量变化相反，第1～3周迅速下降，第3周降至最低值，且与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理增加果实APX活性，而叶片降低，与AsA变化恰好相反，APX活性降低有助于确保AsA含量积累与稳定。可知，黑穗醋栗果实和叶片AsA再生能力在维持AsA含量中起重要作用，可能在特定条件和发育阶段调控AsA水平。

GSH/GSSG比值用来衡量谷胱甘肽氧化还原状态，表明AsA-GSH循环在AsA生成中起重要作用。GSH/GSSG越高代表GSH量越高，同时表明更多DHA可通过DHAR和GSH作用转化为AsA[34]。本研究结果表明，黑穗醋栗果实GSH/GSSG总是大于叶片，且叶片GSH/GSSG与AsA含量呈正相关。枝条摘叶处理后，叶片中无论GSH含量还是GSH/GSSG均有下降趋势，说明摘叶处理对叶片抗坏血酸AsA-GSH循环有影响，而果实无影响。摘叶处理后，对照组果实GR活性略大于处理组，但无显著差异，说明摘叶处理对果实GR活性影响较小。摘叶处理后第3周，叶片GR活性迅速升高，与同期对照组差异显著，其他坐果时期并无显著差异，与番茄研究结果一致[10]，表明GSH和GR参与AsAGSH循环完成黑穗醋栗AsA积累。

目前研究发现植物细胞质、叶绿体和胞外环境中均含有AsA，且AsA浓度达毫克级，AsA在细胞内和细胞间均可自由移动，说明植物中存在高效AsA跨膜和长距离转运系统[35]。AsA长距离运输机制的提出，使植物库器官AsA形成机制复杂化。本试验摘叶处理对果实AsA含量产生影响，因此推测AsA在叶片和果实中存在长距离运输关系。Qin等通过摘果处理测试黑穗醋栗AsA是否存在长距离运输，发现摘果处理前叶片AsA含量较高，摘果处理后，叶片AsA含量立即下降，果实AsA水平高于叶片[12]。因此，这种现象可能是黑穗醋栗叶片和果实之间AsA长距离运输的间接证据，与本试验摘叶处理结果吻合。

此外，Hancock等通过多种试验证明黑穗醋栗叶片合成的AsA对果实AsA积累无影响，认为L-半乳糖是AsA合成途径，还发现树莓AsA主要取决于自身合成能力，不存在AsA运输，但叶片对果实糖供应能力可能对树莓AsA合成具有调控作用[36]。Hancock等研究指出，AsA从源叶到果实运输取决于果实生长阶段，如摘除黑穗醋栗花朵或番茄果实不影响其果实AsA积累[36-37]。刺梨在果实发育后期开始积累AsA，直至果实成熟，接近成熟时AsA积累速率最高，表明果实内AsA积累受不同生长发育阶段调控[9]。因此作物不同可能导致AsA积累不同，黑穗醋栗AsA长距离运输尚需进一步验证。

摘叶处理改变果实表面光照、温度等外部环境条件，影响黑穗醋栗果实AsA最终含量。黑穗醋栗摘叶处理后，叶片减少影响AsA含量及相关酶活性，果实和叶片存在差异。本试验结果表明，摘叶处理后，叶片AsA含量及其他酶活性均增加，而果实AsA含量、APX及MDHAR活性降低，GSH含量、DHAR和GR活性无变化。本试验初步推断黑穗醋栗果实和叶片AsA含量关系，可用同位素示踪法验证。黑穗醋栗AsA主要合成途径是L-半乳糖途径，其两种关键酶L-半乳糖脱氢酶和L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶如何在摘果或摘叶中调控叶片和果实AsA含量，需进一步研究。