藏猪IFN-λ3成熟肽基因克隆及原核表达、抗病毒效价测定

李原野， 殷 玥， 陈瑛琪， 张继宗，杨晓宇，王佳煜，朱 玲,2， 徐志文,2*

（1.四川农业大学动物医学院，成都 611130，2.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，成都 611130）

Ⅲ型与Ⅰ型干扰素生物学功能相似，但Ⅲ型干扰素受体广泛分布于上皮组织和器官，具有更强的特异性，在造血和神经系统分布较少，临床应用副作用较小。Ⅲ型干扰素抗病毒活性研究发现，IFN-λ3抗病毒活性显著高于IFN-λ1和 IFN-λ2。根据干扰素抗猪水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）活性测定干扰素效价[1]，VSV系统对各种干扰素敏感度较高，活性测定效果较好[2]。IFN-λ属于Ⅱ类细胞因子，其与Ⅰ型干扰素具有相似抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能，其特异性受体IFN-λR1主要在上皮细胞组织表达，在黏膜表面表现特异性的抗病毒功能[3-4]。猪IFN-λ包括IFN-λ1和IFN-λ3，后者抗病毒活性更强[5]。Wang等在猪外周血淋巴细胞中克隆得到IFN-λ1基因[6]，Shen等利用 Poly I：C诱导ST细胞克隆 IFN-λ3基因[7]。目前，关于猪IFN-λ其他成员尚未见报道。Ⅰ型干扰素已用于治疗多种临床疾病，如慢性髓性白血病、黑色素瘤、丙型肝炎等[8-9]。

本文首次以提取藏猪肺脏和肠道总RNA为模板，通过RT-PCR方法成功获取藏猪IFN-λ3基因序列。以pMD19-T-ZPoIFN-λ3质粒为模板，克隆ZPoIFN-λ3成熟肽基因（pMD19-T-mZPoIFN-λ3），构建原核表达载体pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3，于大肠杆菌BL21（DE3）中表达，纯化重组质粒，并通过MDBK/VSV系统测定其抗病毒效价，为进一步研究藏猪IFN-λ3生物学特性和相关基因重组药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 肺脏、质粒与菌株

藏猪肺脏和肠采自四川省甘孜自治州规模化猪场，E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、质粒pMD19-T、表达质粒pET-32a(+)均由四川农业大学动物生物技术中心保存。

1.2 酶和试剂

PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA Marker DL2000、GoldViewTM染色剂、TaKaRa RNAisoTM Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit、DNA Ligation Kit Ver.2.1、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0购自宝日医生物技术（北京）有限公司，蛋白Marker、限制性内切酶QuickCut™Bam HⅠ、Quick Cut™HindⅢ、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司；辣根HRP标记羊抗鼠IgG(H+L)高交叉吸附二级抗体购自赛默飞世尔（中国）公司。

1.3 PCR引物

根据GenBank公布的猪IFN-λ3序列（NM_001166490），利用Primer 5.0设计扩增藏猪IFN-λ3全长序列引物。引物序列如下：P1：5'ATGGCCCT GGGTGGCT 3'， P2：5'TCAGACACACAGGTCTCC AC 3'。P1和P2由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根据克隆到的藏猪IFN-λ3基因序列，设计扩增藏猪IFN-λ3成熟肽基因引物。分别在上游引物（P3）和下游引物（P4）5'端加Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点。P3：5'CGCGGATCCGTGCCTGTCCCT GAAGCCC 3'，（划线部分为Bam HⅠ酶切位点）P4：5'CCCAAGCTTTCAGACACACAGGTCTCCAC 3'（划线部分为HindⅢ酶切位点）P3和P4由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 藏猪肺和肠总RNA提取及cDNA合成

取新鲜藏猪肺脏和肠道组织，液氮反复研磨，取100 mg组织置于EP管中，参照试剂盒说明书提取肺和肠组织总RNA、纯化肺和肠组织的RNA，1%琼脂糖电泳（AGE）检查。以总RNA提取液3 μL为模板，反转录合成cDNA（反应条件：37℃，15 min；85℃，5 s）。

1.5 pMD19-T-ZPoIFN-λ3质粒构建与鉴定

以cDNA为模板，扩增IFN-λ3全基因（反应体系：cDNA 2 μL，10 pmol·μL-1P1、P2 各 1 μL，PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL;反应条件：95℃，5 min；95℃，30 s；54℃ ，30 s；72℃，40 s；35个循环；72℃，10 min），预期产物约600 bp。PCR产物回收纯化后与pMD19-T载体连接，再转化入E.coli DH5α，阳性单菌落经PCR测序鉴定，克隆命名为pMD19-T-ZPoIFN-λ3。

1.6 IFN-λ3成熟肽基因扩增及重组表达载体构建

以pMD19-T-ZPoIFN-λ3为模板，作藏猪IFN-λ3成熟肽基因扩增（反应体系：2 μL pMD19-TZPoIFN-λ3，上下游引物（10 pmol· μL-1）P3、P4各 1 μL， 12.5 μL PrimeSTAR Max Premix， 6 μL ddH2O，反应条件95℃，7 min；95℃，30 s；65℃，30 s；72℃，40 s；共30个循环；72℃，10 min；4℃，保存），扩增产物经1%AGE鉴定后回收纯化。将IFN-λ3成熟肽PCR产物和载体PET-32α(+)用限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ在37℃条件下酶切30 min（双酶切体系为IFN-λ3/PET-32α 1 μg，10×酶切Buffer 2 μL，Bam HⅠ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL），将IFN-λ3酶切片段与PET-32α(+)酶切产物于16℃连接过夜，连接产物转化入E.coli.BL21（DE3）感受态细胞后，涂布于LB平板（含Amp 100 μg·mL-1），37 ℃恒温需氧培养12～24 h。挑取单个菌落接种于LB肉汤（含Amp），37℃180 r·min-1振荡培养 12～14 h，取菌液作 PCR 鉴定，取阳性转化子抽提质粒，Bam HⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，将菌落PCR与双酶切鉴定正确的阳性克隆转化子送上海生工测序。

1.7 诱导剂IPTG浓度及诱导表达时间优化

将重组菌BL21-IFN-λ3接种于LB肉汤（含Amp）37 ℃ 220 r·min-1振荡培养12 h，按1∶100比例转种至LB肉汤（含Amp）中培养OD600=0.6时，加入IPTG使终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1诱导5 h，收集菌体作全菌SDS-PAGE分析。当重组菌BL21-IFN-λ3培养至OD600=0.6时，加入IPTG溶液使终浓度达优化后水平，诱导至1、2、3、4、5 h时，分别取1 mL菌液作SDSPAGE检测分析。

1.8 表达产物定位分析及Western Blot鉴定

优化后结果作重组菌BL21-IFN-λ3培养及诱导表达，4℃12 000 r·min-1（Sigma 3k15 Inc）离心10 min，弃上清，用1/10体积PBS（pH 8.0）重悬沉淀，加入适量裂解液，冰浴下超声破碎至溶液清澈。4℃ 12 000 r·min-1离心15 min收集上清和沉淀，沉淀用PBS重悬。取少量上清液和沉淀重悬液，加入等体积5×Loading Buffer，SDS-PAGE分析。破碎后离心收集上清，加入等体积平衡缓冲液（10 mmol·L-1Tris-HCl，8 mol·L-1尿素，500 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1咪唑，pH 8.0）混匀，0.45 nm滤膜过滤，滤液按照上海生工公司Ni-NTA SefinoseTM Resin Kit试剂盒使用说明操作。洗脱蛋白经10 ku超滤管浓缩。将诱导表达和未诱导产物与纯化融合蛋白作SDS-PAGE分析，转PVDF膜，后作Western Blot分析，一抗为鼠ZPoIFN-λ3多克隆抗体，二抗为HRP标记羊抗鼠IgG。

2 结果与分析

2.1 IFN-λ3全基因及成熟肽序列扩增

以抽提藏猪肺和肠组织RNA为模板，RT-PCR扩增IFN-λ3基因全长序列，扩增产物经1%AGE检测，约600 bp位置处出现与预期长度相符单一条带（见图1）。将目的片段扩增至克隆载体pMD19-T，转化大肠杆菌DH5α，对转化子作菌落PCR鉴定（见图2），阳性克隆送成都擎科梓熙生物技术公司测序，获得碱基序列为612 bp，将测序结果与NCBI网站Blast比对，使用MEGA 5.0等软件，将本研究序列与GenBank中已发表野猪（NM_0011664 90.1）、牛（NM_001281901.1）、树鼩（JX185489.1）、人（AY184374.1）、小鼠（NM_177396.1）、狮头鸡（NM_001128496.1）、人（AY184374.1）、西方爪蟾（NM_001171766.1）IFN-λ3的作同源性分析（见图3），构建进化树（见图4）结果显示，藏猪IFN-λ3与野猪、牛、树鼩、人、小鼠、狮头鸡和西方爪蟾核酸序列相似性分别为100%、84.9%、80.2%、78.9%、72.5%、51.8%、43.1%，表明克隆成功，以P3/P4为引物，pMD19-T-IFN-λ3为模板扩增IFN-λ3成熟肽序列，扩增得到1条约500 bp条带，与预期相符（见图5），未加模板阴性对照未见条带，说明成功扩增IFN-λ3成熟肽。

图1 藏猪IFN-λ3 PCR扩增Fig.1 PCR amplification of Tibetan pig IFN-λ3 gene

图2 pMD19-T-ZPoIFN-λ3 PCR鉴定Fig.2 PCR identification of the pMD19-T-ZPoIFN-λ3

图3 目的基因同其他物种序列同源性比较Fig.3 Homologies of target genes with other species sequences

图4 ZPoIFN-λ3氨基酸序列系统发育树构建Fig.4 Phylogenetic ree based on amion acid sequence of ZPoIFN-λ3

图5 藏猪IFN-λ3成熟蛋白基因PCR扩增Fig.5 PCR amplification of Tibetan pig IFN-λ3 mature peptide sequence

2.2 重组表达载体pET32α-IGF-1构建与鉴定

回收成熟肽基因片段与质粒pET-32α(+)分别双酶切后，连接酶连接，获取重组质粒，转化E.coli.BL21（DE3），阳性菌株作菌落PCR鉴定，另小量提取质粒后用Bam HⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，均可得到约500 bp IFN-λ3序列片段，与预期产物一致（见图6、7），质粒送公司测序鉴定，正确转化子命名为BL21-IFN-λ3。

2.3 藏猪IFN-λ3融合蛋白IPTG浓度优化

pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3转化BL21(DE3)菌株培养至对数生长期，使用终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8或1.0 mmol·L-1的IPTG，摇床中37 ℃诱导5 h。SDS-PAGE结果发现，IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1时目的蛋白表达量最大（见图8）。

图6 pMD19-T-mZPoIFN-λ3 PCR鉴定Fig.6 PCR identification of the pMD19-T-mZPoIFN-λ3

图7 重组质粒pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3酶切鉴定Fig.7 Identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3 by restriction enayme digestion

图8 IPTG浓度对重组蛋白表达影响Fig.8 Effect of recombinant protein expression with different concentration of IPTG

2.4 IFN-λ3融合蛋白诱导时间优化

pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3转化 BL21（DE3）菌株培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1，在空气摇床中37℃条件下诱导，诱导后1、2、3、4、5 h分别取样作SDS-PAGE分析，不同诱导时间均有目的蛋白表达且呈时间依赖，诱导5 h蛋白表达量最多（见图9）。选择5 h作为最佳诱导时间。

2.5 重组蛋白纯化和Western Blot鉴定

利用融合蛋白组氨酸标签，将洗涤后包涵体通过Ni-NTA亲和层析法去除杂蛋白，250 mmol·L-1咪唑洗脱液洗脱，洗脱液通过SDS-PAGE检测为单一条带（见图10）。洗脱蛋白通过透析法复性以及PEG-20000浓缩，使用考马斯亮蓝G250法测定蛋白浓度为1.13 mg·mL-1。纯化后融合蛋白制备鼠ZPoIFN-λ3多克隆抗体，将纯化pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表达藏猪IFN-λ3成熟蛋白经12%SDSPAGE电泳分离后，置于转膜槽中冰浴转膜，90 V电压转膜40 min，使用鼠高免血清作为一抗，作Western Bolting鉴定，发现在目的蛋白处出现条带（见图10），说明原核表达的藏猪IFN-λ3融合蛋白具有良好免疫原性。

图9 诱导时间对重组蛋白表达影响Fig.9 Effect of recombinant protein expression with different culture times

图10 检测复性浓缩后藏猪IFN-λ3重组蛋白Fig.10 Detection of renaturation recombination protein of Tibetan procine IFN-λ3

2.6 重组IFN-λ3蛋白抗病毒活性效价测定

pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表达藏猪IFN-λ3融合蛋白抗病毒效价采用细胞病变抑制法，使用VSV/MDBK系统测定（见图11）。

通过计算可得，距离比＝（高于50%的百分比-50）/（高于50%的百分比-低于50%的百分比）＝（75-50）/（75-25）＝0.5，pET-32a(+)-mPoIFN-λ3表达蛋白在MDBK/VSV系统抗病毒效价为10×24.5U·0.1 mL-1，蛋白质浓度为1.13 mg·mL-1，比活力为2×103U·mg-1（见表1）。

图11 MDBK细胞CPE观察Fig.11 Observation of MDBK cell CPE

表1 ZPoIFN-λ3抗病毒活性效价测定Table 1 Determination of ZPoIFN-λ3 antiviral effect

3 讨论与结论

藏猪为世界少有高原型原始放牧猪种，是我国唯一生活在高原高寒地区的地方小型原始猪种，具有对恶劣环境适应力强、抗病力强及耐粗饲等特点。本试验选用藏猪为研究对象，克隆藏猪IFN-λ3基因并分析其生物信息学，以期探索藏猪抗病力分子机制及其开发利用价值。本试验扩增得到藏猪IFN-λ3基因，克隆测序鉴定后与Gen-Bank序列比对，其与野猪相似性最高为100%，与西方爪蟾相似性最低为43.1%。提示IFN-λ3基因在不同动物中具有同源性。

目前猪源Ⅰ和Ⅱ型IFN在动物疾病防治中的抗病毒机制研究较成熟，但IFN-λ相关研究较少，猪IFN-λ1对PRRSV、伪狂犬病病毒（PRV）、FMDV细胞增殖有抑制作用，且剂量依赖程度较高[10-11]。周恒等通过在细胞中加入不同浓度重组猪IFN-λ3，分析猪IFN-λ3原核表达及其活性，发现高浓度细胞孔出现细胞皱缩及死亡，低浓度细胞孔中未发现细胞死亡，为干扰素临床使用剂量研究提供理论依据[12]。

本研究成功构建原核表达载体pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3，将其转化至表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）[13-14]，获得高效表达藏猪IFN-λ3融合蛋白菌株[15]。选用MDBK/VSV系统，通过细胞病变抑制法测定猪IFN-λ3重组蛋白活性，发现高浓度蛋白造成细胞死亡。原因是原核表达产物某些成分有一定毒性，需在纯化及透析过程中去除毒性成分，优化临床抗病毒活性使用剂量。研究可为研究猪Ⅲ型干扰素的生物学功能奠定理论基础，为临床新药物研发提供新方向。