改良镇静技术促进鸡胚荷瘤模型的磁共振成像研究

2018-11-02左智左鹏飞王鑫史秋寅丁建东左扬松马根山

东南大学学报（医学版） 2018年5期

左智，左鹏飞，王鑫，史秋寅，丁建东，左扬松，马根山

(1.东南大学附属中大医院心血管内科，江苏南京 210009；2.涟水县人民医院呼吸内科，江苏涟水 223400)

鸡胚模型已被广泛应用于多种研究领域[1- 12]，但其影像学研究却困难重重[13- 19]。究其原因主要在于鸡胚的“胎动”。在鸡蛋中鸡胚漂浮在尿囊液中，无法对其进行物理固定；多种麻醉药物也被证实效果甚微，甚至可能产生毒副作用、降低存活率[13]。磁共振扫描通常需要一定的时间，在鸡胚移动的情况下会出现运动伪影，图像质量大打折扣。有些研究者将鸡胚处死后再进行扫描[11,17,20- 24]，虽然消除了伪影，但重复观察失去可能，研究深度和意义都受到极大的限制。

低温冷却对鸡胚具有镇静效果，Bain等[16]在4 ℃冰箱内冷却鸡胚1 h，可以实现一定程度的镇静。但随着鸡胚发育，其对1 h的冷却耐受逐渐增强，孵育10 d后需要更长时间来保证镇静效果[25]。我们设计了在4 ℃ 环境下依据鸡胚孵育日龄制定个体化的冷却时间，保证足够长时间的镇静效果。本研究在使用改良镇静技术后，对鸡胚荷瘤模型进行充分的影像学观察，大大扩展了该模型在肿瘤研究领域的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料

受精的鸡蛋购于本地农场，经清洁后置于孵化箱中，孵化环境设置为温度37.8 ℃、湿度60%。孵化4 d后在鸡蛋气室端开窗，注意不要损伤尿囊膜。开窗后检查鸡胚是否发育正常，移除未受精的、死亡的鸡蛋。选取尿囊膜血管网丰富的鸡蛋，在尿囊膜正中间移植肿瘤细胞，移植后用医用胶布封闭鸡蛋的开口，妥善放置回孵化箱中。

1.2 方法

1.2.1 改良冷却镇静技术用29只鸡胚改良冷却镇静技术，随机分为3组：A组(n=10)作为对照持续孵化，不予人为干预；B组(n=10)每天在4 ℃冰箱冷却1 h；C组(n=9)用于确定每日龄鸡胚最佳的冷却时间。C组再随机分为C1、C2、C3 3个亚组，每个亚组3个鸡胚。随着鸡胚孵化日龄的增加，对冷却时长的需求也增加。C1组使用与前一日相同的冷却时长，C2组多冷却10 min，而C3组在此基础上再多冷却10 min，冷却后立即使用磁共振扫描确定是否达到镇静。取3个亚组磁共振成像(MRI)没有伪影的最短冷却时长作为该日龄的最佳时长。

1.2.2 移植肿瘤细胞本研究使用人乳腺癌细胞MDA- MB- 231细胞系，在含10%FBS的L- 15培养基中培养。在鸡胚孵化第7天，在尿囊膜上放置直径为6 mm 的橡胶圈，2×106个肿瘤细胞混合在20 μl浓度为50%的Matrigel基质胶中，种植于橡胶圈范围内(图1)。

肿瘤细胞移植96 h后形成了肉眼可见的实体肿瘤黑箭头：实体移植瘤；白箭头：用来限制肿瘤生长范围的橡胶圈

图1鸡胚荷瘤模型实物图像

1.2.3 磁共振扫描使用Bruker高场11.7T动物磁共振系统、60 mm正交线圈完成扫描。从肿瘤细胞移植后的第4天到第9天，每天使用快速自旋回波(rapid aquicision with relaxation enhancement, RARE)序列扫描获得T2加权图像，具体参数如下：重复时间(TR)/回波时间(TE)4 320/45 ms, 矩阵数目650×650,分辨率77 μm×91 μm,层厚0.5 mm,层间距为零,RARE值8,激励次数4。

1.2.4 定量分析肿瘤体积、评估肿瘤重量、病理组织学分析在每一个MRI图像层面上使用Segment软件描记肿瘤轮廓，计算切面面积，所有层面面积总和乘以层厚估算出肿瘤体积。作时间-体积点线图评估肿瘤的增殖趋势。在最后1天所有扫描完成后处死鸡胚，切下实体肿瘤，称重并用福尔马林保存。将肿瘤标本冷冻切片并染色，与所获得的MRI图像对比，评价充分镇静后的MRI的质量与可靠程度。

1.3 统计学处理

使用SPSS软件进行数据分析，Speramanrho测试、Mahn- Whitney U测试用于评估磁共振估算的肿瘤体积和肿瘤重量的关联程度，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 改良镇静技术

通过实验我们发现，对于孵化日龄大于10 d的鸡胚，1 h的常规冷却已经达不到预期的镇静效果，运动伪影严重影响了MRI。经过C组每一天的比较，我们总结出1份改良镇静时间表，详见表1。使用改良镇静技术可以保证孵化6～18 d的鸡胚充分镇静，而且并不会提高鸡胚的死亡率，非常安全。

表1改良冷却镇静技术

孵化日龄冷却时长(达到镇静的最短时间)/minA组(n=10)B组(n=10)C组(n=9)6060607060608060609060601006070110607012060701306090140609015060110160601101706012018060120存活率0.8(8/10)0.9(9/10)0.89(8/9)

2.2 高分辨率MRI

改良后延长的镇静时间允许我们使用分辨率更高、耗时更长的磁共振序列，获得的图像像素可以精确到77 μm×91 μm。图像精度、清晰度大大提高，可以观察非常小的解剖结构。我们可以清楚地看到每一天鸡胚大脑、心脏、眼、肝脏、肌胃、膝关节、肺、小肠、喙以及脊椎的生长(图2)，这在以往是非常不可思议的。

1.脑；2.心脏；3.眼；4.肝脏；5.胃(俗称鸡胗)；6.膝关节；7.肺；8.小肠；9.鸡喙；10.脊椎

图2鸡胚生长过程的磁共振图像

2.3 肿瘤增殖的MRI分析

15只荷瘤鸡胚用于观察肿瘤增殖，其中2只鸡胚死亡，4只肿瘤细胞没有成功移植，剩下的9只完成了每日1次的磁共振扫描。MRI下清晰地观察到肿瘤每日的增殖过程(图3)。每一天每只荷瘤鸡胚都获得了相当高质量的MRI图像。通过分析我们发现，虽然9只鸡蛋都被移植了2×106个肿瘤细胞，但肿瘤的增殖速度、最终长成的实体瘤的体积大小却不尽相同(图4)。在肿瘤细胞移植后的第9天，肿瘤的体积悬殊，4～37.5 mm3。去除了结缔组织、血管后，最终实体瘤的体积为0.77～18.77 mm3。尿囊膜移植瘤的具体结构见图5，包括实体瘤部分、血管以及一些疏松结缔组织。研究中并没有观察到肿瘤的生长对于鸡胚发育的异常影响。

在肿瘤被移除后对其称重，9个肿瘤的重量见表2。对于磁共振测量的体积以及实际肿瘤的称重进行回归分析，二者存在显著的线性关系，R2=0.9，P<0.01。平均重量/体积的值等于0.78 mg·mm-3，与已知数据1 mg·mm-3相比差异无统计学意义(P>0.65)。

2.4 病理结果

肿瘤的病理结果见图6，可以发现移植瘤的结构分为数个部分，和尿囊膜直接接触的部分细胞密度最高，而离尿囊膜稍远的肿瘤中心部分细胞密度较低，血管新生程度也较低。

3 讨论

观察肿瘤增殖对于研发抗肿瘤药物非常重要。目前裸鼠是荷瘤动物的金标准，但其成本高，且动物伦理的审核越来越严格。在实验动物福利和保护的大前提下，裸鼠研究将需要越来越大的经济和时间成本。鸡胚作为活体模型早已得到广泛使用，由于尚未发育完善的免疫系统、血供丰富可直视的尿囊膜结构，具有作为荷瘤载体的重大价值和潜力[4]。使用鸡胚荷瘤模型进行短期预实验，可以降低实验成本，减少裸鼠使用数量，提高实验效率。

在肿瘤研究中影像学数据必不可少，无创的磁共振扫描能在不干预实验样本的情况下提供相当多的信息。截至目前，活体鸡胚MRI的最小像素为200 μm×200 μm[13- 16,18,24- 26]。鸡胚的不稳定限制了单次扫描的时长，但是图像分辨率越高，花费的扫描时间越长。而移植瘤由于只有数天的增殖时间，体积不会太大，内在结构更加微小，且往往形状不规则。因此若想使用磁共振来分析这些肿瘤，高分辨率的必要性不言而喻。本研究改良了Bain团队的冷却镇静技术[16,26]，按照日龄的增加确定了每天最优的冷却时间，在保证安全的前提下提高了镇静效率，将成像像素进一步缩小到77 μm×91 μm。

粉色圆圈内为逐渐长大的实体瘤

图3移植瘤成像及肿瘤增殖观察

与免疫组化结果的对比证明了改良后磁共振评估的可靠性与精确程度。由于远离血供，肿瘤核心部分细胞密度较低、新生血管欠活跃，磁共振图像中观察到明显减低的信号密度；实体肿瘤的外周部分在磁共振图像中呈现较高的信号，这与组织学证明的丰富的血管系统、密集的肿瘤细胞与活跃的增殖迁移结果一致。本研究成功地使用了磁共振观察鸡胚荷瘤的发展过程，这都得益于改良镇静技术，使鸡胚荷瘤模型的应用价值大大提高。