MicroRNA- 485- 5p抑制人结直肠癌细胞增殖和侵袭作用的研究

胡秀秀，潘玉琴，王书奎

[1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)中心实验室，江苏 南京 210012]

结直肠癌是发生于结肠或直肠中的常见消化道肿瘤之一。近年来受到人口老龄化和环境污染等影响，结直肠癌发病率和死亡率居高不下[1]，已经成为国内外医学领域的研究重点。microRNAs(miRNAs)是一种进化上保守的内源性非编码RNA，通过转录后调控靶基因的表达，在生长发育、细胞增殖分化、肿瘤发生发展等一系列病理生理过程中发挥着重要作用[2]。miRNA- 485- 5p在多种肿瘤如口腔鳞状细胞癌、黑色素瘤、肺腺癌、胃癌、乳腺癌等中被报道为抑癌基因。但miR- 485- 5p在结直肠癌中的功能尚未见报道。因此，本研究旨在探讨miR- 485- 5p对结直肠癌细胞的增殖、侵袭等表型的影响及其可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1 质粒的构建

miR- 485- 5p潜在靶基因CD147的3′端非编码区(3- untranslated region，3′UTR)野生型(WT，包括预测的miR- 485- 5p靶位点)和突变型(Mut，miR- 485- 5p结合位点的8个核苷酸被替换)质粒由苏州泓迅生物科技股份有限公司构建，其序列经DNA测序证实无误。

1.2 细胞培养及转染

293细胞、正常肠黏膜细胞(FHC)和2种人的结直肠癌细胞(HCT8和HCT116)均购自中国科学院上海细胞生物研究所。4种细胞在含有10%胎牛血清(FBS，Hyclone，美国)的高糖型DMEM培养基(Hyclone，美国)中常规培养。miR- 485- 5p模拟物(miR- 485- 5p mimic)及其相应的阴性对照(miR- NC)由广州锐博公司合成。当细胞融合度达到30%～50%时使用Lipofectamine 3000(Invitrogen，美国)进行转染。转染步骤参照说明书。

1.3 总RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT- PCR)

采用TRIzol法(Invitrogen，美国)提取总RNA，采用上海吉玛公司的染料法Hairpin- it miRNAs qRT- PCR定量试剂盒检测miR- 485- 5p，引物亦由上海吉玛公司合成,U6作为内源性对照。用PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRa，中国)进行RNA逆转录后，SYBR4®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa，中国)检测CD147 mRNA的表达，β- 肌动蛋白(β- actin)作为内参。待测基因引物设计：CD147上游引物为5′- CCATGCTGGTCTGCAAGTCAG- 3′，下游引物为5′- CCGTTCATGAGGGCCTTGTC- 3′；β- actin上游引物为5′- CTGGAACGGTGAAGGTGACA- 3′，下游引物为5′- AAGGGACTTCCTGTAACAACGCA- 3′。所有反应均在Applied Biosystems 7500型定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)上进行。通过2-ΔΔCt方法分析CD147和miR- 485- 5p的相对表达水平。

1.4 CCK- 8法检测细胞增殖能力

使用CCK- 8溶液(凯基，中国)检测转染miR- 485- 5p mimic或miR- NC 24、48、72和96 h的HCT8和HCT116细胞的存活率。每个时间点设6个复孔，实验重复3次。

1.5 Transwell法检测细胞侵袭能力

在Transwell小室中测定已转染miR- 485- 5p mimic或miR- NC的结直肠癌细胞的侵袭能力。实验步骤如文献[3]描述。

1.6 Western blotting检测蛋白表达

实验步骤如文献[4]描述，抗体如下：CD147(目录号Ab108317，Abcam，1∶5 000)、GAPDH(目录号ab181602，Abcam，1∶10 000)及山羊抗兔IgG- HRP(目录号Ab6721，Abcam，1∶10 000)。

1.7 双荧光素酶报告基因检测靶基因

使用Lipofectamine 3000将miR- 485- 5p mimic或miR- NC与合成的双荧光素酶报告基因CD147- 3′UTR- WT或CD147- 3′UTR- Mut共转染293细胞，随后用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天，中国)在发光检测仪(GloMax- 20/20 Luminometer，Promega，美国)中检测转染48 h后的荧光素酶活性。

1.8 统计学处理

使用IBM SPSS 19.0统计软件进行数据分析。数据以均数±标准差表示，两组数据的比较采用t检验，多组数据的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR- 485- 5p在人结直肠癌细胞中的表达

荧光定量PCR结果显示,miR- 485- 5p在人结直肠癌细胞株HCT8和HCT116中的表达水平较FHC细胞显著降低(P<0.05，图1)。

与FHC细胞比较，aP<0.05

图1各组细胞中miR-485-5p的表达情况

Fig1ExpressionofmiR-485-5pinvariousgroupsofcells

2.2 miR- 485- 5p mimic在HCT116和HCT8细胞中的转染效率

为了研究miR- 485- 5p对结直肠癌细胞生物学功能的影响，HCT116和HCT8细胞分别转染miR- 485- 5p mimic或miR- NC，采用qRT- PCR检测转染效率。实验结果表明,HCT116和HCT8转染miR- 485- 5p mimic后，miR- 485- 5p的表达分别增高332倍和309倍(图2)。因此可以看出，miR- 485- 5p mimic及阴性对照转染良好，转染方案能够有效地提高结直肠癌细胞中miR- 485- 5p的表达，有利于后续的细胞功能学和靶基因的实验研究。

U6为内对照，aP<0.001

图2qRT-PCR检测miR-485-5pmimic及miR-NC在人结直肠癌细胞中的转染效率

Fig2DetectionofmiR-485-5pmimicandmiR-NCtransfectionefficiencyinhumancolorectalcancercellsbyqRT-PCR

2.3 miR- 485- 5p过表达对人结直肠癌细胞增殖能力的影响

与miR- NC组相比，过表达miR- 485- 5p在48 h后能够显著抑制HCT116细胞的增殖能力，在72 h后能够显著抑制HCT8细胞的增殖能力(图3)。提示miR- 485- 5p过表达能够抑制人结直肠癌细胞的增殖。

与miR- NC组比较，aP<0.05

图3CCK-8实验检测转染人结直肠癌细胞的增殖能力

Fig3CCK-8assayforproliferationoftransfectedhumancolorectalcancercells

2.4 miR- 485- 5p过表达对人结直肠癌细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，miR- 485- 5p过表达组细胞的侵袭数目显著低于miR- NC组(图4)，提示miR- 485- 5p过表达能够抑制人结直肠癌细胞的体外侵袭能力。

与miR- NC组比较，aP<0.01

图4Transwell实验检测转染人结直肠癌细胞的侵袭能力(×200)

Fig4Transwellassayfortheinvasionoftransfectedhumancolorectalcancercells(×200)

2.5 miR- 485- 5p靶基因预测和双荧光素酶报告基因实验验证

miRNA靶基因预测软件microRNA.org (http://www.microrna.org/)和miRDB(http://mirdb.org/)提示CD147可能为miR- 485- 5p调控的靶基因。双荧光素酶报告基因检测结果显示，CD147- 3′UTR- WT和miR- 485- 5p mimic共转染后荧光素酶水平明显下降，CD147- 3′UTR- Mut和miR- 485- 5p mimic共转染后则没有明显的下降(P>0.05，图5)，提示miR- 485- 5p对CD147可能有直接的调控作用。

与miR- NC+WT组比较，aP<0.01

图5双荧光素酶报告基因实验验证靶基因

Fig5Dualluciferasereporterassaysverifytargetgenes

2.6 miR- 485- 5p过表达对人结直肠癌细胞中CD147表达的影响

qRT- PCR及Western blotting结果显示，miR- 485- 5p过表达组细胞中CD147 mRNA和蛋白表达均显著低于miR- NC组(图6)。结果提示miR- 485- 5p过表达能够抑制人结直肠癌细胞中CD147的表达。

与miR- NC组比较，aP<0.01

图6qRT-PCR及Westernblotting检测转染后人结直肠癌细胞CD147表达

Fig6DetectionofCD147expressioninhumancolorectalcancercellsaftertransfectionbyqRT-PCRandWesternblotting

3 讨 论

越来越多的证据表明，miRNA作为抑癌基因或者促癌基因，在结直肠癌的基因调控机制中扮演着重要角色。因此，研究结直肠癌相关miRNA将加深对结直肠癌发生发展分子机制的认识，为这种致命癌症的有效治疗提供新的视角。

研究表明，miR- 485- 5p在多种肿瘤中低表达并可抑制肿瘤的发生和发展。Guo等[5]报道miR- 485- 5p发挥了抑癌作用，其可能调控肝癌细胞的增殖和侵袭，同时也证实斯钙素2(stanniocalcin 2，STC2)是miR- 485- 5p的直接靶点。与这些报道一致，我们发现2种结直肠癌细胞系中miR- 485- 5p的表达水平比正常肠黏膜细胞低，提示miR- 485- 5p的低表达可能与结直肠癌的进展有关;在功能实验上，上调miR- 485- 5p的表达可以明显抑制结直肠癌细胞增殖和侵袭。miRNA靶基因预测软件提示CD147可能是miR- 485- 5p的潜在下游靶标。CD147是广泛表达于多种细胞表面的一种单链跨膜糖蛋白，在人体内多种组织细胞如粒细胞、骨髓造血细胞、内皮细胞、活化的T细胞、分化的巨噬细胞等都检测到CD147的表达[6- 8]。其可以与不同的蛋白偶联，参与调节机体多种生理过程。研究发现CD147不仅在体内正常的组织细胞中有表达，其在多种肿瘤细胞中也被检测到且通常表达量增高，主要包括结直肠癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和黑色素瘤等[9- 13]。研究表明，CD147与肿瘤的侵袭、转移、血管形成、化学耐药等方面都相关[14- 15]。CD147可诱导细胞产生能够降解细胞外基质或基底膜的多种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[16]；CD147可以与单羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporters，MCTs)结合，促进MCTs对细胞内无氧糖酵解过程中产生的乳酸的转运，流向肿瘤细胞的乳酸使肿瘤细胞生长的微环境酸化，进而促进肿瘤细胞的侵袭与转移等[17]；CD147还能够诱导血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，参与肿瘤血管的形成过程[18]。因此，CD147在肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要的作用。在本研究中，双荧光素酶报告基因检测证实miR- 485- 5p可与CD147的3′UTR部分结合。在通过转染miR- 485- 5p mimic，上调其在结直肠癌细胞中的表达后，qRT- PCR和Western boltting均检测到CD147下调。这些发现表明CD147和miR- 485- 5p之间呈显著负相关。因此，我们认为miR- 485- 5p可能直接靶向调节CD147，抑制结直肠癌的生长和侵袭。但是CD147不是唯一可以被miR- 485- 5p靶向调节的。众所周知，单个miRNA可能调控大量的mRNA，而单个mRNA也可以被多个miRNA调控。miR- 485- 5p及其靶基因CD147只是复杂调控网络中的一个因素。探索miR- 485- 5p调控的其他基因或调节CD147的其他miRNA是必不可少的，这将能够更深入地了解结直肠癌发病的分子机制。

本研究揭示了miR- 485- 5p的异常表达与结直肠癌生理病理过程之间的潜在关系。miR- 485- 5p在结直肠癌细胞中的表达下调，外源miR- 485- 5p通过调节CD147抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭。这些发现为我们提供了一个新的视角，可能有助于开发一些新的有价值的结直肠癌预防和治疗方法。另一方面，导致miR- 485- 5p表达下调的机制以及miR- 485- 5p抑制结直肠癌发生发展的机制仍需进一步研究。