鸡新城疫病毒抗原制备参数优化相关性研究

赵英娜 杨平 贾红梅 陈申秒



鸡新城疫病毒抗原制备参数优化相关性研究

赵英娜 杨平 贾红梅 陈申秒

（山东滨州沃华生物工程有限公司 256606）

本试验主要以NDV弱毒株为试验对象探讨了几种培养因素对鸡胚尿囊液收量和血凝效价的影响。试验选择 9、10、11 日龄非免疫鸡胚以3个接种剂量分别接种NDV Lasota株病毒液于鸡胚尿囊腔中。结果表明，选用10日龄鸡胚接种剂量为0.1ml／枚时获得尿囊液量和血凝效价为最高。

新城疫病毒 鸡胚尿囊液 接种剂量 血凝效价

新城疫(Newcastle disease, ND)是威胁养禽业发展的一种重要传染病，给养禽业造成巨大经济损失，OIE将其与高致病性禽流感一起列为危害养禽业必须报告的疫病，该病在我国时有发生。同时NDV也是诱导全血产生细胞因子的重要诱导剂如NDV诱导生产血源性干扰素[1, 2，3]。近年来，在生产上出现了高致病性的强毒株，甚至超强毒株，一旦发生，难于控制，往往出现极高的死亡率，给养鸡业带来毁灭性的打击。防制本病的有效方法是对鸡群进行免疫接种，常用的疫苗有弱毒疫苗和灭活疫苗。随着毒株毒力的加强，常常要结合ND油乳剂灭活苗接种才能取得较好的效果而在灭活苗的生产中，目前仍主要采用鸡胚作为病毒的繁殖载体。因此，获得高效价的病毒液(尿囊液)是制苗的关键。试验对如何获得高效价的尿囊液，确定接种时种毒的最佳浓度及鸡胚尿囊液的最佳收集时间进行探讨。通过对不同日龄的鸡胚接种不同剂量的NDV，观察其对鸡胚尿囊液量及血凝效价的影响，评价最佳种毒接种日龄、接种剂量及其实用性，旨在为ND油乳剂灭活苗的规模化生产提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）非免疫鸡胚，由济南、德州等地种鸡场提供；（2）新城疫Lasota病毒株，由中国兽医药品监察所提供；（3）电热恒温培养箱SKP—02.600，购自黄石市恒丰医疗器械有限公司；（4）移液器QY-100ml，购自北京青云卓立精密设备有限公司；（5）1%鸡红细胞悬液，0.01mol /L PBS液(pH值7.4)等按常规方法配制。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚的孵化 取非免疫种蛋180枚，随机分为9组，每组20枚，放置同一培养箱孵化，孵化温度37.0℃，相对湿度51%~55%，每隔2h翻蛋1次。5d头照检出无精蛋和死精蛋；9d起每6h照蛋1次，检出死胚，24h内死亡的剔除。

1.2.2 接种 用NDV -Lasota株分别尿囊腔接种9日龄(I组)10日龄(II组)11日龄(Ⅲ组)鸡胚，接种剂量分别为：I--1组、II--1组、Ⅲ--1组0.10ml/枚，I--2组、II--2组、Ⅲ--2组0.15ml/枚，I--3组、II--3组、Ⅲ--3组0.20ml/枚。

1.2.3 检测方法 接种后96~120h放4℃冰箱过夜，次日收获。吸出尿囊液置50ml量筒中分别量取每个鸡胚中的尿囊液量。用血液凝集试验(HA)分别测每组鸡胚尿囊液中新城疫病毒的平均效价。

2 结果

2.1 尿囊液量与接种剂量的关系

9、10、11日龄鸡胚分别按3个不同剂量接种NDV后，各组鸡胚产生的尿囊液量的差异(见附表)。

附表 鸡胚接种不同剂量NDV对鸡胚尿囊液的影响(ml/枚、log2)

项目9日龄10日龄11日龄 I-1I-2I-3II-1II-2II-3III-1III-2III-3 接种剂量0.100.150.200.100.150.200.100.150.20 尿囊液收量13.5413.4413.4313.7313.6313.5913.6713.6413.61 平均HA效价212212212212212212211211211

由附表可以得出，接种0.1ml/枚的收量显著高于0.2ml/枚的，而接种0.15ml/枚的和0.2ml/枚的则无显著差异。从生成的尿囊液量多少来看，接种0.1ml/枚的所得尿囊液量最多，0.15ml/枚的次之，0.2ml/枚的最少。

2.2 尿囊液量与接种日龄的关系

表1~3表明，不同接种日龄所取得的尿囊液量有显著差异，在10、11日龄组中，所取得的尿囊液量显著高于9日龄所取得的尿囊液量，其平均值分别为13.47ml/枚、13.65ml/枚、13.64ml/枚，10、11日龄之间无显著差异。

2.3 尿囊液血凝效价与接种剂量、接种日龄的关系

从试验结果可知，9日龄与10日龄接种组的平均效价无明显差异，但高于11日龄组的HA效价，尿囊液血凝效价与接种剂量关系不大。

3 讨论

（1）试验结果表明，接种剂量对鸡胚尿囊液量有显著影响，接种剂量增大，则尿囊液量逐渐减少；接种剂量对鸡胚尿囊液的效价影响不大；接种日龄对鸡胚尿囊液量有显著影响。（2）NDV接种后的血凝效价受到很多因素的影响，如鸡胚种源差异、孵化技术﹑培养温度、接种剂量、接种日龄、种毒稀释倍数等，而NDV血凝效价易受接种病毒量的影响，因此，NDV接种量、培养温度以及接种胚龄的选择是获得NDV高收量和高效价的关键。本试验结果表明选择10日龄接种，接种剂量为0.1ml/枚的Ⅱ-1组为最佳接种组，可获得多量高效价的尿囊液。（3）鸡胚接种受环境影响较严重，因此接种操作应严格按照有关规定，采用无菌操作，接种鸡胚时应避开胚体和血管，以免影响胚体发育，使病毒增殖速度减缓或停止，从而减少尿囊液的收集量。（4）不同病毒的增殖有不同的接种途径，同一种病毒接种不同日龄鸡胚所获得的病毒量也不同。在实际生产中，应根据不同病毒培养所需要的时间选择恰当的接种日龄和接种剂量以获得最高的病毒液量。

[1] 王兴龙, 金宁一, 丁壮. 新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性[J]. 中国兽医学报,2001, 21 (6): 533-535.

[2] 邝荣禄, 禽病学[M], 北京: 中国农业出版社, 2003.

[3] 周杰等. 种毒接种剂量与鸡胚尿囊液量的相关性研究[J].中国家禽, 1999, 21(12): 6-7.

[4] Schsper U M,Full FJ,Ward M DW, et al Virology, 1998, 165: 291-295.

[5] 曹殿军, 李祥瑞, 卢景良等. 新城疫病毒的遗传变异[J]. 国外兽医学-畜禽传染病, 2005, 12(2): 8-10.

[6] 王兴龙等. 新城疫病毒(青岛株)F蛋白基因的克隆和序列分析[J]. 中国兽医学报, 2004, 19(2): 109-113.

[7] 魏建忠等. 新城疫含硒油佐剂疫苗增强肉鸡免疫效果的研究[J]. 中国兽医学报. 1995(2).

（2015–03–17）

S852.65+9

A

1007-1733(2015)07-0006-02