靶向抑制miR- 21对多发性骨髓瘤细胞凋亡、增殖的影响及其作用机制的初步研究

宋慧慧,李原,马钰,凌孙凯歌，葛峥,黄培林

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 血液内科，江苏 南京 210009)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种起源于生发中心后B细胞并能够产生单克隆免疫球蛋白的恶性增殖性疾病，是发病率位居第2位的血液系统恶性肿瘤，目前仍不可治愈[1]。近年来，随着细胞遗传学及分子生物学技术的不断进步，微小RNA(microRNA, miRNA)调控MM细胞恶性克隆性特征的研究也取得了许多显著性的结果[2]。miRNA是一类包含19～22个核苷酸的非编码的小分子RNA，通过抑制靶基因的mRNA翻译或直接降解mRNA来完成基因的转录后调控，超过50%的蛋白质编码基因会受到miRNA的调控[3]。miRNA在调控肿瘤发病的过程中，既可以发挥致癌基因的作用，也可以对肿瘤产生抑癌作用，那些具备致癌功能的miRNA被称为癌基因miRNA。有研究[3- 5]表明，miR- 21在胃癌、肝癌、结直肠癌等实体肿瘤中起到了致癌基因的作用。对血液肿瘤的研究发现，miR- 21表达上调与B细胞淋巴瘤发病相关[6]，同时miR- 21的高表达对MM的发生及耐药性也起到了至关重要的作用，但具体机制尚不清楚。本研究以MM细胞株为研究对象，探讨靶向抑制miR- 21表达对MM细胞生物活性的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人源性骨髓瘤细胞株U266、MM.1S、RPMI8226、NCI- H929、IM- 9(购自American Type Culture Collection)，接种于含10%胎牛血清及青霉素(100 UI·ml-1)、链霉素(100 UI·ml-1)的RPMI- 1640培养液中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养、传代。

1.2 qRT- PCR检测

分别收集对数期细胞株U266、MM.1S、RPMI8226、NCI- H929、IM- 9，用Fermentas试剂盒提取总的RNA，根据试剂盒说明逆转录mRNA为cDNA作为模板，通过qRT- PCR对miR- 21进行检测，miR- 21引物由科佰生物有限公司设计并合成，根据说明配置PCR反应体系，反应条件为：95 ℃变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸60 s，共40个循环。

1.3 基因转染

取对数生长期U266细胞，按6×105个·ml-1接种到6孔细胞培养板，分别加入20 μl Lipofectamine2000试剂、20 μl miR- 21抑制物和20 μl miR- 21抑制物阴性对照物，混匀静置放置25 min，置于CO2培养箱中培养6 h后更换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液进行培养，转染miR- 21抑制物及miR- 21抑制物阴性对照物48 h后收获细胞。本实验使用抑制物终浓度为200 nmol·L-1。

1.4 CCK8法检测细胞活性

取1×106个·ml-1U266细胞株，接种于96孔细胞培养板，分别转染miR- 21抑制物及miR- 21抑制物阴性对照物，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养4 h 后，每孔加入CCK- 8溶液10 μl，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下避光作用6 h，测定450 nm波长处各孔吸光度(A)值(每个样本设3个复孔，实验重复3次)。按公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(%)=(1-A抑制物处理组/A空白对照组)×100%

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

将U266细胞株种于6孔板，实验分组：(1) 实验组：转染miR- 21抑制物的U266细胞株；(2) 阴性对照组：转染miR- 21抑制物阴性对照的U266细胞株；(3) 空 白对照组：U266细胞株。48 h后收集实验组、阴性对照组及空白对照组细胞，将3组细胞分别移入2 ml EP管中，离心后用冰冻PBS洗涤2次，加入细胞染液，室温避光孵育10～15 min，混匀进行流式细胞检测。

1.6 Western blotting检测

收集U266细胞株、转染miR- 21抑制物U266细胞株以及转染miR- 21抑制物阴性对照物的U266细胞株，提取总蛋白。以100 g·L-1SDS- PAGE电泳分离，湿转法转膜，室温下摇床封闭1 h，加入封闭牛奶稀释的PTEN(1∶1 000)、FOXO1(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST充分洗膜后分别加入用TBST稀释(1∶3 000)的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温下摇床孵育1 h，TBST洗膜后化学发光法显色，X线底片曝光，显影、定影。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组细胞株miR- 21表达情况

qRT- PCR检测骨髓瘤细胞株U266、MM.1S、RPMI8226、NCI- H929、IM- 9，以U6作为内参对照。NCI- H929细胞株miR- 21表达水平最低，U266、RPMI8226、MM.1S、IM- 9细胞株miR- 21相对表达量分别是NCI- H929细胞株的(35.68±2.77)倍(P<0.05)、(7.08±0.65)倍(P<0.05)、(3.88±0.32)倍(P<0.05)、(19.94±1.31)倍(P<0.05)。根据检测结果选取U266作为研究对象。

2.2 U266细胞株转染miR- 21抑制物的效率

用Lipofectamine2000将miR- 21抑制物及miR- 21抑制物阴性对照物分别转入U266细胞株中，48 h后收集上述细胞，qRT- PCR检测转染后的miR- 21表达水平变化情况。miR- 21抑制物阴性对照组miR- 21相对表达量高于抑制物实验组(1.015±0.14vs0.286±0.031,P<0.05)，转染抑制率为71.8%。

2.3 miR- 21对U266细胞增殖的影响

U266细胞转染miR- 21抑制物及miR- 21抑制物阴性对照物，CCK- 8实验检测结果显示，转染miR- 21抑制物实验组细胞增殖抑制率为(53.04±0.02)%，与转染miR- 21抑制物阴性对照组细胞增殖抑制率(20.89±0.17)%相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 miR- 21对U266细胞凋亡的影响

流式细胞检测结果显示，转染miR- 21抑制物的U266实验组细胞株凋亡率[(28.53±3.23)%]明显高于转染miR- 21抑制物阴性对照组[(5.12±0.63)%]，差异具有统计学意义(P<0.05)；然而，转染miR- 21抑制物阴性对照组与空白对照组U266细胞凋亡率[(0.92±0.17)%]差异无有统计学意义(P>0.05)(图1)，提示抑制了miR- 21表达的U266细胞株细胞凋亡显著增加。

A.空白对照组；B.转染miR- 21抑制物阴性对照组；C.转染miR- 21抑制物组

图1流式细胞术分析miR-21对U266细胞凋亡的影响

2.5 Western blotting检测蛋白表达

转染miR- 21抑制物的U266细胞PTEN、FOXO1蛋白表达水平显著高于转染miR- 21抑制物阴性对照组及空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)，而阴性对照组与空白对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)，提示miR- 21调控了PTEN和FOXO1蛋白的表达，导致了MM细胞生物学行为的异常。

1.空白对照组；2.转染miR- 21抑制物阴性对照组；3.转染miR- 21抑制物组

图2Westernblotting分析miR-21对U266细胞株相关蛋白表达的影响

3 讨 论

MM是克隆的B细胞恶性疾病，以骨髓中浆细胞异常和不可控制的增殖、骨损害和免疫缺陷为特征。浆细胞的恶性增殖产生大量无功能的单克隆免疫球蛋白和(或)轻链，造成机体贫血、肾脏损伤、骨质破坏、严重感染以及高黏滞综合征、凝血功能异常。迄今为止，它确切的发病机制尚不清楚[7- 8]。miRNA这种小分子RNA可以特异性识别靶mRNA的3′- 非翻译区(3′UTR)并与之结合，引起靶mRNA的降解或翻译抑制。miRNA常常通过与靶基因完全互补结合切割靶mRNA，也可以与靶基因不完全互补结合，进而阻止翻译而不影响mRNA的稳定性。部分miRNA还同时具备双重功能，与靶基因互补结合时直接靶向切割mRNA，与靶基因不完全结合时起调节基因表达的作用。miR- 21是由17q23.2染色体FRA17B脆性区域编码而成，它发挥着癌基因的作用，通过调控靶基因的mRNA和蛋白表达，进而控制细胞的增殖、分化、侵袭等功能。其抑癌作用已经在多种实体肿瘤和部分血液系统肿瘤中得到证实[3- 6]。有研究[9- 12]结果显示，miR- 21可以利用磷酸化、乙酰化、泛素化等作用介导PTEN的表达，而PTEN基因作为一种抑癌基因，具有磷酸酯酶活性及蛋白络氨酸激酶活性，是公认的miR- 21靶基因，接受miR- 21的负性调控。PTEN基因在受到miR- 21调控的同时也影响着FOXO1的水平，它可以减少FOXO1的磷酸化，磷酸化后的FOXO1会被转移出细胞核直接降解。FOXO1作为转录因子在调节细胞代谢、应激反应、细胞周期及凋亡方面均发挥着至关重要的作用。有研究[13]表明它可以减少肿瘤细胞的凋亡、促进其增殖，所以FOXO1蛋白的缺失被认为是导致恶性肿瘤细胞不可控性增殖的重要原因。近年来，FOXO1转录调控的异常与miRNA之间的内在相关性已经成为恶性肿瘤的研究热点。

本研究中，我们选取了5株骨髓瘤细胞株中miR- 21表达最高的U266细胞作为研究对象。靶向抑制U266细胞miR- 21的表达水平，结果显示实验组与阴性对照组、空白对照组相比，实验组细胞增殖抑制率明显提高，而阴性对照组与空白对照组之间无显著差异。流式细胞检测结果也显示出实验组细胞与阴性对照组、空白对照组细胞凋亡比值的差异具有统计学意义。这与miR- 21在其他肿瘤中的报道基本一致，提示miR- 21在肿瘤细胞的生物学行为过程中发挥了癌基因的作用。Western blotting检测结果表明，实验组细胞株下调了miR- 21的表达水平，PTEN作为其靶基因，受到miR- 21的负性调控，所以PTEN蛋白表达增加，而高表达的PTEN弱化了FOXO1的磷酸化作用，使得FOXO1降解减少，故而其蛋白水平也相应升高。这一结果在阴性对照组及空白对照组中也得到了反向的证明。

综上所述，miR- 21在MM细胞中发挥了癌基因的作用，减少miR- 21的表达可以抑制骨髓瘤细胞增殖，促进其凋亡。它可能是通过介导PTEN的水平进而影响下游FOXO1的转录功能，实现对骨髓瘤细胞的调控。本研究结果为MM的发病机制和临床诊疗提供实验依据，值得进一步深入研究。