Mcl- 1抑制剂UMI- 77诱导胆囊癌细胞GBC- SD凋亡的机制研究

张生彬，刘宝琴，董长城，李冰

(内蒙古包钢医院 肝胆外科，内蒙古 包头 014010)

胆囊癌是胆道系统恶性肿瘤中最常见的一种，约占胆道系统肿瘤的2/3，但由于其病因尚未完全明确，缺少特异性的临床表现，病情也很隐匿，因此，一旦确诊为胆囊癌，患者的病情多已发展到中晚期，且大部分都已发生局部浸润或组织转移[1- 2]。肿瘤产生和发展的重要标志之一为细胞凋亡过程发生紊乱，肿瘤细胞凋亡受到抑制也是肿瘤对放化疗不敏感的因素之一，因此，诱导肿瘤细胞发生凋亡是肿瘤治疗的机制之一[3- 4]。凋亡途径分为外源性途径和内源性途径，B淋巴细胞瘤2(B- cell lymphoma 2, Bcl- 2)和髓样细胞白血病- 1(myeloid cell leukemia- 1,Mcl- 1)作为抗凋亡蛋白参与内源性凋亡途径[5]。在细胞学上，胆囊癌的进展过程是细胞增殖和凋亡因子表达失调的结果。在胆囊癌细胞中，抗凋亡因子Bcl- 2、Mcl- 1和B淋巴细胞瘤xL(B- cell lymphoma extra large, Bcl- xL)均呈现过度表达，促凋亡因子Bcl- 2相关X蛋白(Bcl- 2 assaciated X protein, Bax)和Bcl- 2激活抑制蛋白(Bcl- 2 homologous antagonist killer, Bak)均呈现低表达，抗凋亡因子可通过其BH3结构域与促凋亡因子形成异二聚体而保护癌细胞不进入凋亡程序，从而抑制癌细胞的凋亡，促进胆囊癌的发展[6- 7]。近些年来，研究者从Bcl- 2和Mcl- 1入手，合成了多种抗凋亡蛋白的小分子抑制剂，其单独或联合化疗药物使用时均具有较好的疗效[8]。2014年，Abulwerdi等[9]运用结构生物学以及高通量筛选鉴定出Mcl- 1的一种小分子抑制剂UMI- 77，其能和Mcl- 1选择性地结合，从而拮抗Mcl- 1的抗凋亡功能，发挥诱导细胞凋亡及抑制细胞生长的作用。本研究将UMI- 77应用于胆囊癌GBC- SD细胞，了解其诱导胆囊癌细胞发生凋亡的机制，旨在为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人胆囊癌细胞系GBC- SD由中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库提供；Mcl- 1抑制剂UMI- 77购自美国Selleck公司；AnnexinV/PI双染试剂盒购自中国北京晶美生物公司；RPMI 1640培养基和胎牛血清(fetal calf serum，FBS)均购自美国Invitrogen公司；细胞株增殖检测试剂盒购自美国Sigma公司；兔抗人多克隆抗体Mcl- 1(ab28147)、兔抗人多克隆抗体Bcl- 2(ab59348)、兔抗人多克隆抗体Bcl- xL(ab2568)、兔抗人多克隆抗体Bax(ab53154)、兔抗人多克隆抗体Bak(ab69404)、兔抗人多克隆抗体半胱氨酸蛋白酶9剪切(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase, cleaved- caspase 9)(ab2324)、兔抗人多克隆抗体半胱氨酸蛋白酶3剪切(cleaved- caspase 3)(ab2302)和兔抗人单克隆抗体caspase切割底物(cleaved poly ADP- ribose polymerase, cleaved- PARP)(ab32064)、山羊抗兔二抗(ab6721)均购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养

人胆囊癌GBC- SD细胞用含10%胎牛血清(fatal bovine serun, FBS)的RPMI 1640培养基在含5%二氧化碳(CO2)的培养箱内37 ℃采用常规方法进行培养，取对数生长期的细胞进行分组实验。

1.3 噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖

将处于对数生长期的细胞接种于96孔板中(1×106个·孔-1)，每孔100 μl，按梯度加入浓度分别为0、5、10、15、20及30 μmol·L-1的UMI- 77，每组设5个复孔。将各组细胞分别培养12、24及48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，继续培养3～6 h后小心吸去上清，每孔加入100 μl甲瓒溶解液孵育，在酶标仪上测定各孔OD值，同一时间点的OD值取其5个复孔的平均值。细胞存活率(%)=(不同浓度组OD值/0 μmol·L-1组OD值)×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

将处于对数生长期的细胞接种于24孔板中(1×105个·孔-1)，待次日细胞融合达到80%以上后，分别用0、5、10、15、20及30 μmol·L-1的UMI- 77处理，每组设3个复孔，将各组细胞分别培养24 h后，收集各孔细胞加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)重悬并离心，加入300 μl 1×Binding Buffer进行细胞重悬，分别加入5 μl Annexin V- FITC和5 μl碘化丙啶(PI)标记，充分混匀后避光孵育20 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达

Western blotting检测最适作用浓度和最适作用时间下GBC- SD细胞各组Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax、Bak、cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表达。收集各组细胞，经PBS洗涤后加入裂解液进行细胞裂解后离心收集上清，二辛可宁酸(BCA)法测定蛋白浓度，每孔加入20 μl蛋白样品，12%的十二烷基磺酸钠- 聚丙烯酰胺(SDS- PAGE)凝胶电泳后，转印至硝酸纤维素膜(PVDF)上，采用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(以1∶1 000稀释)后4 ℃孵育过夜，经TBST洗涤3次后，加入特异性二抗(以1∶5 000稀释)，室温孵育1 h后洗膜，显影拍照。每组实验重复3次，使用Image J软件对条带进行灰度定量后取其平均值。

1.6 统计学处理

实验数据均以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用SPSS 19.0统计分析软件进行数据处理，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 UMI- 77抑制GBC- SD细胞增殖

MTT检测结果如图1所示，不同浓度的UMI- 77分别作用于GBC- SD细胞不同时间后，其细胞存活率均显著降低，且呈剂量依赖性和时间依赖性。与同期不添加UMI- 77的细胞相比，10 μmol·L-1及以上浓度的UMI- 77处理细胞12、24及48 h后，其细胞存活率均显著降低(P<0.05)，即均能显著抑制细胞增殖。后续研究选择UMI- 77的浓度为10 μmol·L-1，处理时间为24 h。

与0 μmol·L-1处理组相比，aP<0.05

图1不同浓度UMI-77对GBC-SD细胞增殖的抑制作用

Fig1InhibitoryeffectofdifferentconcentrationsofUMI-77ontheproliferationofGBC-SDcells

2.2 UMI- 77促进GBC- SD细胞凋亡

分别用0、5、10、15、20及30 μmol·L-1的UMI- 77处理GBC- SD细胞24 h后，流式细胞术检测细胞凋亡的结果如图2所示，随着药物作用浓度的升高，细胞凋亡率逐渐增加，且呈剂量依赖性。与同期不添加UMI- 77的细胞相比，不同浓度的UMI- 77处理细胞24 h后，其凋亡率均显著增加(P<0.05)，即不同浓度的UMI- 77均能显著促进细胞发生凋亡(图3)。

2.3 UMI- 77对GBC- SD细胞Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax和Bak蛋白表达的影响

Western blotting法检测10 μmol·L-1UMI- 77处理GBC- SD细胞前后抗凋亡蛋白Bcl- 2、Bcl- xL和Mcl- 1，促凋亡蛋白Bax和Bak的表达情况如图4所示。与未经处理细胞组比较，10 μmol·L-1UMI- 77处理GBC- SD细胞24 h后，其抗凋亡蛋白Mcl- 1的表达量显著降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax和Bak的表达量显著升高(P<0.05)，但Bcl- 2和Bcl- xL的蛋白表达量无显著性变化。

2.4 UMI- 77对GBC- SD细胞cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白表达的影响

Western blotting法检测10 μmol·L-1UMI- 77处理GBC- SD细胞前后cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表达情况如图5所示。与未经处理的细胞组比较，10 μmol·L-1UMI- 77处理GBC- SD细胞24 h后，活性片段cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表达量均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

A. 0 μmol·L-1组；B. 5 μmol·L-1组；C. 10 μmol·L-1组；D. 15 μmol·L-1组；E. 20 μmol·L-1组；F. 30 μmol·L-1组

图2不同浓度UMI-77处理GBC-SD细胞24h的凋亡率

Fig2ApoptosisrateofGBC-SDcellstreatedwithdifferentconcentrationsofUMI-77for24h

与0 μmol·L-1组相比，aP<0.05

图3不同浓度UMI-77处理GBC-SD细胞24h的凋亡率

Fig3ApoptosisrateofGBC-SDcellstreatedwithdifferentconcentrationsofUMI-77for24h

3 讨 论

胆囊癌作为一种最常见的胆道系统恶性肿瘤，约占胆道系统肿瘤的2/3，但由于其确切的病因尚未完全阐明，缺少特异性的临床相关指标，病情也较隐匿，因此，确诊为胆囊癌的患者的病情多数已发展到中晚期，且大部分都已发生局部浸润或组织转移[1]。而胆囊癌较易发生耐药反应，且对于放化疗均不敏感，加上其预后极差[10]，因此，探索胆囊癌相关治疗靶点的研究尤其重要。Mcl- 1属于Bcl- 2家族中的抗凋亡分子，其功能强大，作用独特，且半衰期较短，在多种肿瘤组织和细胞中呈现高表达[11- 12]。且当Mcl- 1在肿瘤组织中过表达时，可显著降低Bcl- 2抑制剂的抗肿瘤作用[13]。研究者从Mcl- 1入手，合成了多种抗凋亡蛋白的小分子抑制剂，其单独或联合化疗药物使用时均具有较好的疗效[8]。这些研究表明Mcl- 1可能是肿瘤治疗中的一个新靶点。

肿瘤产生和发展的重要标志之一为细胞凋亡过程发生紊乱，也是肿瘤对放化疗不敏感的因素之一，因此，使用药物促进肿瘤细胞凋亡的发生是肿瘤治疗的机制之一[3- 4]。近年来，关于抗凋亡蛋白抑制剂的研究逐渐增多，其中研究得较多的是关于Bcl- 2蛋白的小分子抑制剂ABT- 737及其口服衍生物ABT- 263，其对大多数抗凋亡蛋白的活性具有抑制作用，但与Mcl- 1的结合较差，出现Mcl- 1高表达的肿瘤细胞往往对ABT- 737产生抗药性，因此，研究Mcl- 1蛋白抑制剂可能对肿瘤的治疗具有重要意义[14- 15]。UMI- 77是Mcl- 1的一种小分子抑制剂，其能和Mcl- 1选择性地结合，从而拮抗Mcl- 1的抗凋亡功能，发挥促凋亡作用[9]。朱雪萍等[16]的研究表明UMI- 77诱导胃癌细胞MGC- 803发生凋亡的机制可能是通过激活内源性凋亡途径，且其凋亡的发生呈现出剂量依赖性。本研究采用不同浓度的UMI- 77处理胆囊癌GBC- SD细胞，结果表明UMI- 77能显著抑制GBC- SD细胞增殖，促进GBC- SD细胞凋亡，且呈剂量依赖性和时间依赖性。UMI- 77处理胆囊癌GBC- SD细胞24 h后，Bcl- 2家族的抗凋亡蛋白Bcl- 2和Bcl- xL的表达并无显著性改变，而Mcl- 1的表达显著下调，促凋亡蛋白Bax和Bak的表达显著上调，进一步证实UMI- 77选择性结合Mcl- 1，下调Mcl- 1在细胞中的表达，阻止了Mcl- 1/Bax及Mcl- 1/Bak的异二聚化，使Bax和Bak蛋白在细胞中的表达增高，促进肿瘤细胞发生凋亡。本研究采用10 μmol·L-1UMI- 77处理GBC- SD细胞24 h后，活性的cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表达量较未处理的细胞均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞内源性凋亡途径又称线粒体途径，它始于线粒体，通过释放细胞凋亡因子募集并激活caspase 9，继而激活下游的caspase 2、caspase 3以及caspase 6等因子启动caspase级联反应，最终导致细胞发生凋亡[17]。肿瘤细胞的凋亡被抑制时，其caspase 3、caspase 9和PARP处于非活化的状态，当UMI- 77处理细胞后，会产生一系列的应激反应，通过caspase级联反应诱导caspase(如cleaved- caspase 3、cleaved- caspase 9)和PARP切割并活化，最终通过内源性凋亡途径诱导细胞发生凋亡。

1表示0 μmol·L-1组；2表示10 μmol·L-1组；与0 μmol·L-1组相比，aP<0.05

A. Western blotting检测Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax和Bak蛋白；B.Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax和Bak蛋白的相对表达量

图4UMI-77对GBC-SD细胞Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak蛋白表达的影响

Fig4EffectsofUMI-77ontheexpressionofMcl-1,Bcl-2,Bcl-xL,BaxandBakproteinsinGBC-SDcells

1表示0 μmol·L-1组；2表示10 μmol·L-1组；与0 μmol·L-1组相比，aP<0.05

A. Western blotting检测cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白；B. cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的相对表达量

图5UMI-77对GBC-SD细胞cleaved-caspase9、cleaved-caspase3和cleaved-PARP蛋白表达的影响

Fig5EffectsofUMI-77ontheexpressionofcleaved-caspase9,cleaved-caspase3andcleaved-PARPproteinsinGBC-SDcells

综上所述，本研究显示Mcl- 1的小分子抑制剂UMI- 77可抑制胆囊癌GBC- SD细胞增殖，且呈剂量依赖性和时间依赖性，同时UMI- 77可通过caspase介导的内源性凋亡途径诱导GBC- SD细胞发生凋亡，且呈剂量依赖性，其凋亡诱导可能是通过下调Mcl- 1的表达实现的，表明Mcl- 1可能成为胆囊癌研究中一个新的治疗靶点，因此，对Mcl- 1的小分子抑制剂UMI- 77发挥抗肿瘤作用的具体机制进行更加深入的研究将会为抗肿瘤治疗提供新选择。