AEG- 1调控eIF4E表达促进胃癌细胞迁移的作用机制

徐可心，吴丹丹，吴圣洁，王雪融

(南京医科大学基础医学院 药理学系，江苏 南京 210029)

胃癌是世界第5大常见恶性肿瘤，在癌症相关死亡中占第3位[1]。因此，了解胃癌转移的分子机制，寻找胃癌转移中起重要作用的分子尤为重要。星形胶质细胞上调基因- 1(astrocyte elevated gene- 1，AEG- 1)[2]也被称为metadherin(MTDH)或者lysine- rich CEACAM- 1 associated protein(LYRIC)，研究证实它参与了乳腺癌的肺部转移[3]。近年来研究发现，AEG- 1的表达与多种肿瘤例如乳腺癌[4]、肺癌[5]、结肠癌[6]、肝癌[7]、胃癌[8]等的临床分型、分期、转移和预后密切相关。既往研究表明，AEG- 1可通过激活PI3K/Akt、MAPK/ERK、NF- κB和Wnt/β- catenin等信号通路促进细胞增殖、存活、代谢、上皮- 间质样转化(epithelial- mesenchymal transition，EMT)、迁移、侵袭、保护性自噬和血管形成等[9]。然而，AEG- 1在胃癌迁移中的作用机制尚未明确。

EMT是肿瘤转移的起始和关键步骤，肿瘤细胞迁移的一个重要标志就是肿瘤细胞发生了EMT。真核翻译起始因子4E(eIF4E)是翻译起始复合物的一个重要组成成分[10]，既往研究表明eIF4E在细胞生长、存活、侵袭、EMT和血管生成中起重要作用，在多种肿瘤细胞中发现eIF4E促进肿瘤形成、转移和复发[11]。提示eIF4E可作为肿瘤诊断的分子标志物及治疗的新靶点[12]。本研究的目的是明确AEG- 1通过上调eIF4E表达促进胃癌细胞的迁移，为eIF4E作为肿瘤诊断的分子标志物及治疗的新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

Lipofectamine 2000®transfection reagent(11668- 019)购自美国Invitrogen公司(Carlsbad, CA, USA)；AEG- 1/MTDH抗体(13860- 1- AP)购自中山金桥生物技术有限公司(中国北京)；eIF4E抗体(9742)购自Cell Signaling Technology.Inc(Beverly，MA，USA)；AEG- 1质粒是在pcDNA的空载体中插入编码AEG- 1的全长DNA序列(由宁夏医科大学刘坤梅教授馈赠)；eIF4E质粒是在p3×flag- CMV- 14的空载体中插入编码eIF4E的全长DNA序列(由美国Emory University的Shi- Yong Sun教授赠送)。AEG- 1、eIF4E siRNA购自上海吉玛公司。AEG- 1 siRNA(共两个序列)5′- CAGAAGAAGAAGAACCGGAdTdT- 3′，5′- GCAGCAAGGCAGUCUUUAAGUTT- 3′；eIF4E siRNA(共两个序列)5′- GGACGAUGGCUAAUUACAU- 3′，5′- AAGCAAACCUGCGGCUGAUCUTT- 3′。

1.2 细胞培养

人胃癌细胞株(SGC7901中分化腺癌)来源于上海生命科学研究院，细胞在含5%胎牛血清(FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)的RPMI 1640(Hyclone, Logan, UT, USA)培养基中于37 ℃、5%CO2条件下培养。

1.3 肿瘤细胞迁移实验

按transwell小室说明书操作，细胞消化重悬于无血清RPMI 1640培养基，吸取400 μl按5×104个·L-1密度接种在transwell小室的上室，吸取600 μl含0.5%FBS RPMI 1640培养基或100 ng·ml-1CXCL12的0.5%FBS的RPMI 1640培养基加入下室，培养24 h后 取出小室，PBS清洗3次，用棉签小心擦去小室上侧的细胞，待干燥后用甲醇固定30 min，晾干后用0.1%结晶紫染色30 min，显微镜下拍摄穿过滤膜进入膜下侧的细胞(发生迁移的细胞)。

1.4 质粒、siRNA瞬时转染实验

细胞以5×105个·孔-1的密度接种于6孔板，待细胞融合度达80%～90%时用1 μg质粒、100 nmol·L-1siRNA按 Lipofectamine®2000说明书进行转染，4～6 h后换正常培养液，进行后续实验。

1.5 Western blotting[13]

提取全细胞蛋白(裂解液即1%Triton，成分为HEPES(pH=7.5)40 mmol·L-1，EDTA 1 mmol·L-1，NaCl 120 mmol·L-1，焦磷酸钠10 mmol·L-1，NaF 50 mmol·L-1，原钒酸钠0.5 mmol·L-1，甘油磷酸钠10 mmol·L-1，1% Triton X- 100，PMSF临用前加，终浓度为1 mmol·L-1)，考马斯亮蓝法测蛋白浓度(考马斯亮蓝G- 250液：称取0.1 g考马斯亮蓝G- 250，先加入50 ml 95%乙醇，再加100 ml 85%磷酸，单蒸水定容至1 000 ml后滤纸过滤，常温避光保存)。Western blotting实验即用SDS- PAGE电泳分离蛋白，电转至PVDF膜[蛋白电泳、电转装置(9204355 Rev A)和电源购自美国Bio- Rad公司]后依次孵育一抗、PBST洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL显影、荧光化学发光成像(ChemiScope 3400 Mini，购自上海勤翔科技有限公司)，具体操作过程见我们既往发表的文章[12]。

1.6 统计学处理

所有数据均采用均数±标准差表示，两组之间的比较采用双侧Student’st检验，数据均采用GraphPadInStat 3.0统计软件进行统计，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 过表达AEG- 1诱导细胞发生EMT，同时上调eIF4E的表达

为了探讨AEG- 1在胃癌细胞迁移中的作用，我们首先检测了过表达AEG- 1对EMT的影响。结果显示，在HEK- 293T和SGC7901细胞上瞬时转染编码AEG- 1的质粒，与对照质粒pcDNA转染组相比，转染AEG- 1组的AEG- 1蛋白表达明显增加。而且过表达AEG- 1组的细胞上，上皮细胞标志物E- cadherin表达减少，间质细胞标志物N- cadherin表达增加，提示发生了EMT。我们同时发现，eIF4E和cyclinD1的表达都增加，提示过表达AEG- 1上调eIF4E的蛋白表达，并诱导胃癌细胞发生EMT(图1)。

2.2 沉默AEG- 1的表达抑制细胞发生EMT，同时下调eIF4E的表达

我们在SGC7901细胞上用lipofectamin转染AEG- 1的siRNAs和对照siRNAs瞬时沉默AEG- 1的表达，结果显示，与对照组相比AEG- 1siRNAs转染组AEG- 1的蛋白表达水平明显降低，而且沉默AEG- 1表达组E- cadherin表达上调，N- cadherin表达下调，提示抑制了EMT。同时，我们发现eIF4E和cyclinD1的表达下调，结果提示沉默AEG- 1下调eIF4E的表达并抑制胃癌细胞发生EMT(图2)。

2.3 沉默AEG- 1的表达抑制胃癌细胞的迁移以及CXCL12诱导的胃癌细胞迁移，并同时下调eIF4E的表达

发生EMT是细胞迁移侵袭的初始步骤，接着我们用transwell的方法检测了干扰AEG- 1的表达对SGC7901细胞株迁移能力的影响。结果显示，与对照组相比，沉默AEG- 1组迁移到小室下室一侧的细胞数目明显减少，提示沉默AEG- 1表达抑制了胃癌细胞的迁移能力。我们既往研究报道CXCL12促进了胃癌细胞的迁移，因此我们接着检测了给予CLCX12刺激对细胞迁移的影响。结果显示，与对照组相比，CXC12组下室的细胞数目明显增多，提示胃癌细胞的迁移能力增强；沉默AEG- 1再给予CLCX12刺激，与只给予CLCX12刺激组相比下室的细胞数目减少，但与只沉默AEG- 1组相比下室的细胞数目增多，提示沉默AEG- 1可减弱CXCL12诱导的细胞迁移(图3A)。Western blotting结果显示，与对照组相比，AEG- 1沉默组eIF4E和cyclin D1表达减少，CXCL12处理组二者表达增加，而既沉默AEG- 1表达又给予CXCL12处理组eIF4E和cyclin D1的表达介于上述两组之间。提示给予或不给予CXCL12刺激时，沉默AEG- 1的表达均可抑制细胞的迁移，而且同时伴有eIF4E的表达下调，cyclinD1表达下调(图3B)。

图1Westernblotting检测结果图

NC：阴性对照

图2Westernblotting检测结果图

NC：阴性对照

图3Transwell(A)及Westernblotting(B)检测结果图

2.4 过表达eIF4E部分逆转沉默AEG- 1表达引起的细胞迁移的抑制作用

上述研究都检测到了eIF4E在AEG- 1调控胃癌细胞EMT和迁移中的伴随变化，为了探讨eIF4E在AEG- 1诱导的胃癌细胞迁移中的作用，我们在SGC7901 AEG- 1稳定沉默的细胞株上过表达eIF4E进行transwell实验。结果显示，单独沉默AEG- 1抑制细胞迁移，过表达eIF4E促进细胞迁移，而同时沉默AEG- 1和过表达eIF4E的组，穿过微孔膜的细胞数介于上述两组之间。结果说明过表达eIF4E可以部分逆转沉默AEG- 1的表达引起的细胞迁移的抑制(图4)。

Control：scramble shRNA

图4transwell检测结果图

3 讨 论

本研究我们探讨了AEG- 1在胃癌细胞迁移中的作用和机制。结果发现沉默AEG- 1的表达引起上皮细胞标志物E- cadherin的表达增高，间质细胞标志物N- cadherin的表达降低，提示抑制胃癌细胞发生EMT。反之过表达AEG- 1观察到相反的变化，提示AEG- 1促进胃癌细胞发生EMT。这些结果表明AEG- 1通过诱导EMT来促进胃癌细胞的迁移。既往的研究发现AEG- 1通过Wnt/β- catenin和LPS/TLR4/p65NF- κB信号通路来调节胃癌细胞的生长、凋亡和炎症反应[14- 15]，但在肿瘤迁移中的机制仍未明确。

AEG- 1下游信号分子主要有PI3K/Akt、NF- κB、MAPK/ERK、c- Myc、Wnt和cyclinD1[16]，我们的研究中也观察到沉默AEG- 1的表达下调cyclinD 1的蛋白表达，与既往的研究报道一致。激活eIF4E的活化是某些具有较长5′- UTR结构的mRNA翻译起始的限速步骤，在多种肿瘤转移中起重要作用。我们的研究发现过表达AEG- 1上调eIF4E的蛋白表达，沉默AEG- 1下调eIF4E的蛋白表达，提示eIF4E在AEG- 1诱导胃癌细胞发生迁移中起重要作用，但具体的调控机制仍不明确。已有的研究报道，AEG- 1通过激活PI3K/Akt信号通路激活转录因子FOXO1、FOXO3a、NF- κB和AP- 1[17- 19]，AEG- 1也可以直接和p65 NF- κB、SND1和PLZF相互作用来调节基因转录[20- 22]，都可能通过间接的机制上调eIF4E的表达。此外，在表观遗传学水平、eIF4E启动子区域组蛋白和DNA修饰如乙酰化和甲基化也可能调控eIF4E的转录表达。因此，AEG- 1调控eIF4E的机制有待进一步研究。

综上所述，AEG- 1通过上调eIF4E的表达促进胃癌细胞的迁移，我们的研究进一步证实了AEG- 1在胃癌细胞迁移中的重要作用以及揭示了AEG- 1通过eIF4E促进胃癌细胞迁移的分子作用机制，为胃癌转移的治疗提供了新的靶点和治疗策略。