SU11274逆转HGF诱导非小细胞肺癌对厄洛替尼耐药的作用及其机制

吴叶丹，崔晶刚，安昌善

(1 延边大学附属医院，吉林延吉133000；2 苏州市立医院)

以铂类药物为主的联合化疗方案是治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的常用手段，但其客观有效率仅30%左右。近年随着对信号转导通路以及分子靶向药物研究的不断深入，分子靶向治疗成为最具希望的NSCLC治疗策略。厄洛替尼是目前常用的分子靶向药物之一，在NSCLC治疗初期疗效显著，但随着治疗时间延长，不可避免地出现原发性或继发性耐药现象。厄洛替尼的耐药机制尚不完全清楚。研究发现，Met及其配体肝细胞生长因子(HGF)与多种实体肿瘤的进展和转移有关[1～4]，26%～40%的EGFR基因突变型NSCLC患者伴有HGF高表达和EGFR-T790M突变，其中5%～33%的患者伴有Met基因扩增和EGFR-T790M突变，4%～7%的患者伴有HGF高表达和Met基因扩增[5～7]。人胚肺成纤维细胞MRC-5分泌的HGF可诱导NSCLC细胞对厄洛替尼耐药，其机制可能与刺激c-Met信号转导通路有关[8]。SU11274是一种靶向c-Met的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，可抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭、转移。2016年7～12月，本研究观察了SU11274对HGF诱导NSCLC厄洛替尼耐药的逆转作用。现分析结果并报告如下。

1 材料

人NSCLC细胞株PC-9(EGFR突变型，敏感株)，由同济大学附属上海市肺科医院中心实验室提供。人胚肺成纤维细胞MRC-5，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。雌性BALB/c裸鼠49只，SPF级，4周龄，14～16 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2003-0003。所有裸鼠饮用水过氯化为12～15 ppm，饲料由120 ℃高压蒸气灭菌45 min，每日维持10 h光照+14 h黑暗的明暗周期。厄洛替尼原料药，大连美仑生物技术有限公司。SU11274，美国Sigma公司。SynergyTMH1全功能酶标仪，美国BioTek公司。HGF(人源)ELISA试剂盒，美国R&D Systems公司。1% Tween-80，上海弘顺生物科技有限公司。RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、还原型5×SDS上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL化学发光试剂，美国Thermo Fisher Scientific公司。兔抗人c-Met、兔抗人磷酸化c-Met(p-c-Met)、兔抗人Akt、兔抗人磷酸化Akt(p-Akt)、兔抗人Erk1/2、兔抗人磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)单抗，美国CST公司；兔抗人Stat3、兔抗人磷酸化Stat3(p-Stat3)单抗，美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，美国Epitomics公司。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.2 HGF体外对厄洛替尼抑制PC-9细胞增殖作用及其机制

2.2.1 MRC-5细胞培养上清液HGF水平观察 取传3代以上、对数生长期PC-9细胞和MRC-5细胞，用含EDTA的胰酶消化3 min，800 r/min离心4 min，收集细胞，以2×105个/孔接种于6孔板(孔内加入含双抗和10% FBS的DMEM培养液2 mL)，置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱孵育48 h。将6孔板中的细胞培养液转移至离心管中，以800 r/min离心4 min，留取上清液，-80 ℃保存待测。采用SynergyTMH1全功能酶标仪、ELISA法检测两种细胞培养上清液HGF。所有操作严格按试剂盒说明进行。实验重复3次，取平均值。结果显示，PC-9细胞培养上清液HGF水平<0.1 pg/mL，MRC-5细胞培养上清液HGF水平为(1 262.07±89.78)pg/mL。表明MRC-5细胞能分泌HGF，而PC-9细胞不分泌HGF。

2.2.2 HGF对厄洛替尼抑制PC-9细胞增殖作用 取传5代、对数生长期PC-9细胞，以5×103个/孔种于96孔板，待细胞贴壁，分别加入0.01～0.1 μmol/L厄洛替尼(共设10个浓度梯度，每个浓度梯度增加0.01 μmol/L，每个浓度梯度设4个复孔)，置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱继续培养。培养24 h，每孔加入5 mg/mL的 MTT 20 μL，继续孵育4 h，小心吸尽孔内培养上清液，再加入DMSO 200 μL，充分振荡混匀，使结晶完全溶解。酶标仪于530 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值，计算细胞增殖率。实验重复3次，取平均值。结果显示，0.01～0.1 μmol/L厄洛替尼作用后，PC-9细胞增殖率从80%降至20%(表明细胞增殖率随厄洛替尼浓度增加而降低，即厄洛替尼可抑制PC-9细胞增殖，并呈浓度依赖性)，根据细胞增殖率计算得出厄洛替尼IC50为(0.05±0.01)μmol/L。将PC-9细胞接种于含DMEM与50% MRC-5细胞培养上清液(DMEM与MRC-5细胞培养上清液等体积混合)的培养液中，按上述方法检测厄洛替尼IC50时PC-9细胞增殖率，结果显示，加入50% MRC-5细胞培养上清液后，在厄洛替尼IC50时PC-9细胞增殖率为78.24%。表明HGF能抑制厄洛替尼对PC-9细胞增殖的抑制作用。

2.2.3 HGF对PC-9细胞c-Met及其下游通道蛋白表达的影响 采用Western blotting法。取传3代以上、对数生长期PC-9细胞，随机分为HGF组和空白组，分别以5×105个/孔接种于含或不含50% MRC-5细胞培养上清液的6孔板中，置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱培养。培养48 h收集细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量合格，然后加入还原型5×SDS上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白30～40 μg，100 V恒压下行SDS-PAGE 120 min。电泳结束，以半干转膜法将蛋白电泳产物转印至NC膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，分别兔抗人c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2及p-c-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2、GAPDH单抗(稀释比均为1∶400)，4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(稀释比为1∶1 000)，室温摇床上孵育1 h。TBST洗膜，ECL发光、显影。采用Tanon GIS系列数码凝胶图像处理系统扫描各蛋白电泳条带，Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。结果见表1。

表1 各组c-Met及其下游通道蛋白相对表达量比较

注：与空白组比较，*P<0.05。

2.3 SU11274在裸鼠体内对厄洛替尼耐药的逆转作用

2.3.1 裸鼠皮下移植瘤模型制作及干预 所有裸鼠适应性喂养1周，以随机区组法分为对照组、HGF组、HGF+DMSO组、HGF+SU11274组、厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼+SU11274组，每组7只。对照组和厄洛替尼组于右肋皮下接种密度为5×106个/mL PC-9细胞悬液100 μL，其他组均于右肋皮下接种密度相同的PC-9细胞与MRC-5细胞培养上清液的混合液100 μL。当肿瘤直径生长至约4 mm时，对照组、HGF组予1% Tween-80 10 mL/(kg·d)灌胃，HGF+DMSO组予10% DMSO 10 mL/(kg·d)灌胃，厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼+SU11274组予厄洛替尼25 mg/(kg·d)灌胃，每周5次，连续4周。HGF+SU11274组、HGF+厄洛替尼+SU11274组灌胃后腹腔注射SU11274 0.18 mg/(kg·d)，每周5次，连续4周。

2.3.2 抑瘤率观察 各组分别于灌胃4、7、11、14、18、21、25天，以游标卡尺测量肿瘤长径(L)、肿瘤短径(D)，计算肿瘤体积(V)。V=0.5×L×D2。各组移植瘤体积见表2。末次灌胃结束，断颈处死，完整剥离移植瘤组织，称取肿瘤质量，计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组肿瘤质量-实验组肿瘤质量)/对照组肿瘤质量×100%。结果显示，对照组、HGF组、HGF+SU11274组、HGF+DMSO组、厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼+SU11274组移植瘤质量分别为(680.31±373.38)、(804.84±492.36)、(712.71±258.15)、(566.07±363.59)、(108.89±83.76)、(361.19±172.08)、(106.04±41.03)mg。HGF组、HGF+SU11274组、HGF+DMSO组抑瘤率均接近于0，厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼+SU11274组抑瘤率分别为83.99%、46.91%、84.41%。与HGF+厄洛替尼组比较，厄洛替尼组与HGF+厄洛替尼+SU11274组抑瘤率明显升高(P均<0.05)，而厄洛替尼组与HGF+厄洛替尼+SU11274组比较P>0.05。结果提示，HGF可抑制厄洛替尼的抗肿瘤作用，而SU11274能逆转HGF对厄洛替尼的抗肿瘤作用，提高厄洛替尼的抗肿瘤效果。

表2 各组移植瘤体积比较

注：与对照组比较，△P<0.05；与HGF组比较，☆P<0.05；与HGF+SU11274组比较，◇P<0.05；与厄洛替尼组比较，▽P<0.05；与HGF+厄洛替尼组比较，#P<0.05。

2.3.3 移植瘤组织c-Met及其下游通道蛋白表达 取各组移植瘤组织，固定、包埋，制作石蜡切片。将石蜡切片脱蜡、水化后，用3% H2O2室温孵育30 min，微波炉加热抗原修复，5%羊血清室温封闭30 min。弃羊血清，加入p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2、c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2一抗(稀释比均为1∶200)，4 ℃孵育过夜。次日加入HRP标记的二抗(稀释比为1∶200)，室温孵育2 h。DAB显色，苏木素复液，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。c-Met、p-Met定位于细胞膜和细胞质，Stat3、Erk1/2定位于细胞质，p-Stat3、p-Erk1/2定位于细胞核，Akt、p-Akt定位于细胞质，均呈棕色颗粒。每张切片随机选取10个200倍视野，采用IPP6.0图像分析软件进行对光密度的半定量分析。结果见表3。

表3 各组移植瘤组织c-Met及其下游通道蛋白相对表达量比较

注：与对照组、HGF+SU11274组、厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼+SU11274组比较，*P<0.05；与对照组、HGF组、HGF+DMSO组、HGF+厄洛替尼组比较,#P<0.05；与对照组、HGF+SU11274组、厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼+SU11274组比较,△P>0.05。

3 讨论

EGFR是一种受体型酪氨酸激酶，与配体结合激活后可诱导细胞增殖、分化、迁移及血管生成等[9,10]。第一代可逆性EGFR-TKI及第二代不可逆性EGFR-TKI均能与EGFR共价结合，明显延长EGFR突变基因阳性NSCLC患者无进展生存期[11～14]。TKI应用初期，其单独或联合应用均可阻止NSCLC患者EGFR、c-Met基因突变，但随着应用时间延长，易出现获得性耐药，继而限制了其临床应用。研究证实，EGFR-TKI的耐药机制与HGF诱导c-Met及下游信号通路持续激活有关[15，16]。因此，抑制HGF诱导的c-Met及其下游通路激活有可能逆转NSCLC对EGFR-TKI的耐药。

c-Met蛋白是由50 kDa的细胞外α亚基和140 kDa的跨膜β亚基组成的异二聚体，是一种具有酪氨酸激酶活性的HGF/分散因子受体[17]。HGF与c-Met的Sema区结合可激活下游信号转导通路，如PI3K/Akt、Ras和Rac/Rho和Ras/MAPK等，继而诱导细胞生长、增殖和血管生成等[18]，而在肿瘤细胞中则可促进肿瘤血管生成，继而导致肿瘤细胞浸润和转移[19]。因此，HGF/Met抑制剂成为治疗NSCLC的关键疗法之一。

SU11274是一种特异性靶向c-Met的小分子抑制剂，可特异性抑制c-Met受体信号传导[20]。研究证实， SU11274在Tpr-Met转化细胞及小细胞肺癌模型中均有效[21]。SU11274是依赖HGF信号传导的有效抑制剂，能与Met受体的ATP-poket紧密结合，继而抑制c-Met受体激活且其特异性较高(IC50为10 nmol/L)[22]。SU11274在体外可通过干扰HGF/c-Met信号通路抑制NSCLC、结肠癌、胰腺癌等细胞增殖与侵袭[23，24]。SU11274作为一种Met抑制剂，可逆转由高浓度HGF所致的不同EGFR基因突变型NSCLC细胞对EGFR-TKI耐药[25]。第一代TKI可明显抑制EGFR基因突变型NSCLC生长，但随着HGF浓度升高，激活c-Met及其下游信号通道，可导致肿瘤耐药。联合应用SU11274可明显抑制黑色素瘤生长[26]。此外，SU11274对c-Met激酶活性的抑制导致时间和剂量依赖性的细胞生长减少，下调cyclin D1并诱导肿瘤细胞周期停滞在G1期，并引起细胞凋亡[27]。

本研究细胞实验结果显示，HGF组在厄洛替尼IC50时PC-9细胞增殖率明显低于空白组，磷酸化c-Met及其下游通道蛋白表达明显高于空白组，表明HGF可能通过影响c-Met及其下游蛋白磷酸化而干扰厄洛替尼对PC-9细胞增殖的抑制作用。本研究移植瘤模型实验结果显示，厄洛替尼能够抑制厄洛替尼组、HGF+厄洛替尼组及HGF+厄洛替尼+SU11274组移植瘤生长，对HGF+厄洛替尼+SU11274组抑瘤效果明显高于HGF+厄洛替尼组，但与厄洛替尼组相仿，说明SU11274可逆转HGF介导PC-9细胞对厄洛替尼的耐药，从而恢复厄洛替尼的抗肿瘤作用。进一步观察移植瘤组织c-Met及其下游通道蛋白表达发现，与HGF组、HGF+DMSO组和HGF+厄洛替尼组比较，厄洛替尼组、HGF+SU11274组和HGF+厄洛替尼+SU11274组移植瘤组织p-Met、p-Stat3、p-Akt、p-Erk1/2表达均降低，表明厄洛替尼在HGF诱导下不能抑制PC-9细胞c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2活化，但在无HGF刺激下或HGF刺激下联合应用c-Met抑制剂SU11274则能明显抑制PC-9细胞内c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2磷酸化。

综上所述，HGF可诱导NSCLC对厄洛替尼的耐药，c-Met及其下游信号通路持续激活是NSCLC对厄洛替尼耐药的重要机制；c-Met抑制剂SU11274和厄洛替尼联合应用可逆转HGF诱导的NSCLC对厄洛替尼的耐药，其机制可能与抑制c-Met及其下游信号通路激活有关。