Klotho基因G-395A位点多态性与糖尿病肾病的关系

李杨，黄邓高，郑琳麟，曹卉，高元慧，范忠诚

(中南大学湘雅医学院附属海口医院，海口570208)

糖尿病肾病是糖尿病最严重的慢性并发症之一，目前在我国其患病率已超过慢性肾小球肾炎，已成为慢性肾脏病的首位病因[1]。糖尿病肾病的确切发病机制尚不完全清楚。有研究认为，糖尿病肾病是一种多基因遗传异质性疾病，遗传因素可通过影响肾脏对环境因素的反应性来增加糖尿病肾病的易感性。Klotho基因是一种与衰老有关的基因，主要在肾脏中表达[2～4]，具有抗肾脏纤维化、调节钙磷代谢、抑制氧化应激等多种生物学功能[5]。研究发现，Klotho基因与糖尿病和糖尿病肾病有关，该基因突变会导致其转录功能改变，可能会导致代谢紊乱加重[6]。Klotho基因含有多个单核苷酸多态性位点，其G-395A位点(rs1207568)位于启动子区域，而启动子作为顺式作用元件的一部分，可参与调控基因表达。因此，G-395A位点突变虽不能改变Klotho蛋白的氨基酸序列，但可能是影响Klotho基因表达调控的环节之一。本研究探讨Klotho基因G-395A位点多态性与糖尿病肾病的关系。现分析结果并报告如下。

1 临床资料

选取2016年1月～2017年10月中南大学湘雅医学院附属海口医院收治的单纯2型糖尿病患者147例(单纯糖尿病组)，男76例、女71例，年龄(50.7±5.5)岁，BMI (25.1±1.2)kg/m2；糖尿病肾病患者98例(糖尿病肾病组)，男57例、女41例，年龄(52.0±9.1)岁，BMI (26.6±3.8)kg/m2。糖尿病诊断符合1999年WHO制定的标准，糖尿病肾病诊断符合《中国2型糖尿病防治指南》(2010版)制定的诊断标准。排除合并恶性肿瘤、急慢性感染性疾病者。选择同期在中南大学湘雅医学院附属海口医院体检的健康志愿者100例(健康组)，男57例、女43例，年龄(52.1±6.2)岁，BMI (24.4±3.1)kg/m2。研究对象均为长期生活在海南地区的汉族人，相互之间无血缘关系。三组性别、年龄、BMI具有可比性。本研究经中南大学湘雅医学院附属海口医院医学伦理委员会批准，患者或其家属均知情同意。三组血压、血糖、血脂等相关指标比较见表1。

表1 三组血压和血生化相关指标比较

组别 n TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C (mmol/L) BUN (mmol/L) Scr(μmol/L)健康组 100 1.74±1.42 3.27±1.17 1.51±0.32 5.40±1.28 61.01±13.07单纯糖尿病组147 1.92±1.30 3.24±1.13 1.55±0.28 5.87±1.35 70.08±20.76糖尿病肾病组98 2.40±1.14∗3.65±1.41 1.44±0.40 8.01±1.92∗#118.90±26.10∗#

注：与健康组比较，*P<0.05；与单纯糖尿病组比较，#P<0.05。

2 方法与结果

2.2 Klotho基因G-395A位点多态性检测 三组均采集空腹静脉血4 mL，置于EDTA抗凝管中，室温静置30 min，分离血细胞，按柱式小量血液DNA抽提试剂盒说明抽提基因组DNA。采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术中TaqMan荧光探针法检测G-395A(rs1207568)位点多态性。将选定的G-395A(rs1207568)多态性位点在Applied Biosystems公司网站上查找相应的TaqMan-MGB探针，将探针标号及多态性位点一起送至Applied Biosystems公司合成引物和探针。按PCR反应试剂盒说明配制反应体系，于ABI Prism7300型荧光定量PCR扩增仪按相应的反应条件进行扩增。PCR反应体系共15 μL：20×引物及荧光探针混合溶液0.5 μL，2×TaqMan通用PCR扩增预混试剂7.5 μL，ROX Reference Dye溶液0.3 μL，A模板1.5 μL，灭菌蒸馏水5.2 μL；反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并将测序结果与Klotho基因序列进行Blast比对。采用基因计数法计算各组基因型及等位基因分布。经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，三组Klotho基因G-395A位点基因型分布均符合遗传平衡定律，说明研究对象均具有样本代表性。由于GG基因型相对较少，与GA合并分析。结果显示，健康组GA基因型+GG基因型49例、AA基因型51例，单纯糖尿病组分别为70、77例，糖尿病肾病组分别为30、68例，健康组与单纯糖尿病组AA基因型分布明显低于糖尿病肾病组，GA基因型+GG基因型分布明显高于糖尿病肾病组(P均<0.05)，健康组与单纯糖尿病组AA基因型、GA基因型+GG基因型分布比较P均>0.05；健康组A、G等位基因频数分别为132、68，单纯糖尿病组分别为199、95，糖尿病肾病组分别为157、39，健康组与单纯糖尿病组A等位基因频数明显低于糖尿病肾病组，G等位基因频数明显高于糖尿病肾病组(P均<0.05)，健康组与单纯糖尿病组A、G等位基因频数比较P均>0.05。见表2。

表2 各组Klotho基因G-395A位点基因型和等位基因分布情况

2.3 糖尿病肾病发病的危险因素分析 以糖尿病肾病为应变量，以表1中有统计学差异的指标(SBP、FPG、HbA1c、TC、TG、BUN、Scr)及G-395A位点基因型(AA、GA+GG)为自变量，进行多因素非条件Logistic回归分析，结果显示，SBP、HbA1c、G-395A位点AA基因型分布增加是糖尿病肾病发病的危险因素。见表3。

表3 糖尿病肾病发病的多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

Maeda等[7]通过全基因组关联研究发现，染色体13q区异常与糖尿病肾病的易感性有关。Klotho基因定位于13q12区域，由5个外显子和4个内含子组成，G-395A位点位于其启动子区域，本身并不编码任何蛋白质，而是参与调控基因表达[8]。Klotho基因是一种与衰老有关的基因，具有抗肾脏纤维化、调节钙磷代谢、抑制氧化应激等多种生物学功能。Klotho蛋白主要表达于肾脏、脑组织脉络膜、甲状旁腺等组织，尤其是肾皮质小管上皮细胞[9]。研究发现，Klotho基因表达变化与糖尿病肾病的发生、发展有关，其高表达具有肾脏保护作用[10，11]；早期糖尿病肾病患者肾组织Klotho基因表达降低[12]。体外和体内研究证实，过表达Klotho基因或及时补充外源性Klotho蛋白可保护肾脏结构和功能，延缓糖尿病肾病进展。目前认为，Klotho基因可通过抑制细胞凋亡、抵抗机体内氧化应激和炎症反应，抑制高糖对肾脏的损伤[13]；Klotho基因可调控RAAS系统，调节内皮细胞功能，通过调控多种细胞因子表达，抑制肾脏纤维化；Klotho基因还可调节钙磷代谢，阻止血管平滑肌细胞钙化，调控离子转运，继而保护肾脏[14]。Klotho蛋白缺乏时可通过增强TGF-β1、mTOR信号通路，促进早期糖尿病肾病的发生[15]；而过表达Klotho基因可通过下调早期生长反应因子1而抑制TGF-β1/Smad3信号通路，从而抑制肾小球系膜细胞外基质形成，减轻肾脏纤维化[16]。

Klotho基因G-395A位点是重要的遗传筛选标记和潜在的功能性多态性位点，该位点多态性可影响启动子的转录过程。故本研究观察了海南地区汉族人群Klotho基因G-395A位点多态性与糖尿病肾病的关系。有研究显示，糖尿病患者或小鼠胰岛组织Klotho基因表达降低[17～19]。Lin等[17]研究发现，db/db小鼠胰腺β细胞Klotho基因过表达可改善高血糖所致的β细胞损伤，降低高血糖并增加糖耐量；增加循环中Klotho蛋白对糖尿病患者也有类似效果。Forsberg等[18]研究显示，db/db小鼠肝组织Klotho基因过表达可导致血糖水平下降，胰岛β细胞功能得以改善。上述结果提示，无论过表达Klotho基因还是补充外源性Klotho蛋白对糖尿病均有益。Kawano等[20]应用电泳迁移率变动分析显示，由G等位基因形成的DNA蛋白复合物的量明显高于由A等位基因形成的DNA蛋白复合物的量，提示G突变为A可能通过减少蛋白和启动子的结合而影响Klotho基因的功能。本研究结果显示，Klotho基因G-395A位点出现了AA、GA、GG三种基因型，健康组与单纯糖尿病组AA基因型分布明显低于糖尿病肾病组，GA基因型+GG基因型分布明显高于糖尿病肾病组，而健康组与单纯糖尿病组AA基因型、GA基因型+GG基因型分布比较差异均无统计学意义；健康组与单纯糖尿病组A等位基因频数明显低于糖尿病肾病组，G等位基因频数明显高于糖尿病肾病组，而健康组与单纯糖尿病组A、G等位基因频数比较差异均无统计学意义。多因素Logistic回归分析显示，Klotho基因G-395A位点AA基因型分布增加是发展为糖尿病肾病的危险因素。提示A等位基因可能通过抑制Klotho基因表达，继而导致胰岛β细胞损伤，最终出现糖尿病肾病。但此结论还需大规模、多中心的临床研究验证。

综上所述，Klotho基因G-395A位点多态性与糖尿病肾病发病有关，该位点AA基因型分布增加可能是糖尿病肾病发病的独立危险因素。