miR-146a对肺纤维化小鼠成纤维细胞增殖的影响及其机制

石宇红，任亚飞，蒋亚男，许佳，李宝贞，朱芳晓，莫汉有

(桂林医学院附属医院，广西桂林541002)

肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病终末期改变，其发病机制尚不完全清楚。研究表明，转化生长因子β1(TGF-β1)在肺纤维化的发生、发展中具有重要作用[1,2]；核因子κB(NF-κB)可通过调节TGF-β1分泌影响肺纤维化进程[3]。微小RNA(miRNA)是一类长度约为22 nt的单链非编码小分子RNA，可通过抑制靶基因翻译参与多种重要的生物学过程。miR-146a是miRNA家族成员之一，在NF-κB信号通路中具有负性调控作用，可通过抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6、IL-1受体相关激酶1、母亲DDP同源物蛋白(Smad)等表达而调控NF-κB信号通路[4]。2016年2月～2017年11月，我们观察了miR-146a对肺纤维化小鼠肺成纤维细胞增殖的影响，并探讨其在肺纤维化发生、发展中的作用机制。现报告如下。

1 材料

雄性C57BL/6小鼠30只，SPF级，体质量20～26 g，由桂林医学院实验动物中心提供。RNA反转录试剂盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂，瑞士Roche公司；博来霉素，日本化药株式会社；miR-146a引物、miR-146a mimics(miR-146a激活剂)、miR-146a阴性对照物、β-actin引物，上海捷瑞生物工程有限公司；鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司。Masson染色试剂盒，南京建成生物工程研究所；Western blotting试剂盒，上海拜力生物科技有限公司；RT-PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。

2 方法与结果

2.2 肺纤维化组织miR-146a表达检测

2.2.1 肺纤维化模型制作 将30只小鼠按照随机数字表法分为假手术组和模型组，每组15只。两组均给予1%氯胺酮(100 mg/kg)腹腔内注射麻醉，无菌条件下钝性分离并暴露气管，模型组一次性向气管内滴入博来霉素3.5 mg/kg，假手术组在相同条件下滴入等体积生理盐水，滴完后将小鼠直立并旋转5 min。造模后第28天，两组均给予1%氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉放血后处死，完整分离肺脏，去除结缔组织，将左肺组织迅速放入-80 ℃液氮中冻存，以备提取肺组织总RNA；将右肺组织迅速置于40 g/L甲醛中固定24 h，石蜡包埋，切片，分别行HE染色和Masson染色。HE染色结果显示，假手术组肺泡结构正常，偶见炎性细胞浸润；模型组肺泡结构紊乱，肺泡间隔内可见大量纤维细胞，纤维组织片状或条索状增生，肺泡间隔消失或断裂。Masson染色结果显示，模型组可见大量绿色的胶原纤维堆积，胶原纤维增生。上述结果提示，肺纤维化模型制备成功。

2.2.2 肺纤维化组织miR-146a表达检测 采用RT-PCR法。取出液氮中冻存的左肺组织，采用TRIzol法提取肺组织总RNA，经琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA纯度及浓度合格。将总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。引物由美国Invitrogene公司设计合成，miR-146a上游引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCCATG-3′，下游引物为5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCC-3′；U6 上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应体系共20 μL，包括上下游引物各0.4 μmol/L，Taqman荧光探针0.2 μmol/L，2×Taqman universal PCR Mastermix 10 μL，cDNA 1 μL(相当于0.1 μg RNA)，补水至20 μL。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、62 ℃ 1 min(45个循环)。以U6作为内参，采用标准曲线法计算miR-146a相对表达量。结果显示，模型组及假手术组肺组织miR-146a相对表达量分别为(2.06±0.52)×10-4、(7.25±0.36)×10-4，两组比较P<0.01。

2.3 miR-146a过表达对肺纤维化细胞增殖及NF-κB信号通路相关因子表达的影响

2.3.1 肺成纤维细胞培养及鉴定 取造模第28天模型组肺组织，无菌条件下用眼科剪剪为1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，采用组织块培养法进行成纤维细胞原代培养。HE染色观察细胞形态学特征，可见梭形成纤维细胞排列紧密，细胞核为规则卵圆形，核仁大而明显，胞质透明，并彼此连接成网状。采用免疫细胞化学染色方法检测波形蛋白、肌动蛋白表达，结果显示肌动蛋白阴性、波形蛋白阳性，符合成纤维细胞免疫表型特点。

2.3.2 过表达miR-146a的肺成纤维细胞模型建立 将成纤维细胞接种于6孔板，调整细胞密度为1×105个/孔。随机将细胞分为miR-146a过表达组、对照组、空白组，每组5个复孔。当细胞融合至50%左右时，miR-146a过表达组加入5 μL LipofectamineTM2000转染试剂和6 μL miR-146a mimics，对照组加入5 μL LipofectamineTM2000转染试剂和6 μL miR-146a阴性对照物，空白组加入等体积缓冲液。三组均于培养箱中转染24 h，完全培养基中止转染，再培养36 h，收集细胞，采用RT-PCR法检测miR-146a表达，具体步骤参照2.2.2。结果显示，miR-146a 过表达组miR-146a相对表达量为(7.53±0.68)×10-4，对照组为(1.32±0.12)×10-4，空白组为(1.17±0.25)×10-4；miR-146a过表达组高于其他两组(P均<0.05)，而空白组与对照组比较P>0.05。提示过表达miR-146a的成纤维细胞模型建立成功。

2.3.3 过表达miR-146a的成纤维细胞增殖率检测 采用CCK-8法。取三组转染24 h再培养36 h的对数生长期成纤维细胞，以2×107个/孔密度接种于96孔板，每孔加入15 μL CCK-8溶液，饱和湿度孵育箱中培养2 h。采用酶标仪测定460 nm波长处的吸光度(A460)值，计算细胞增殖率。结果显示，miR-146a 过表达组细胞增殖率为(13.47±1.83)%，对照组为(33.87±1.32)%，空白组为(32.57±1.54)%， miR-146a过表达组低于其他两组(P均<0.05)，而空白组与对照组比较P>0.05。

2.3.4 过表达miR-146a的成纤维细胞NF-κB信号通路相关因子表达检测 采用Western blotting法。取三组转染24 h再培养36 h的对数生长期成纤维细胞，按RIPA试剂盒说明书提取蛋白，经BCA法蛋白定量合格。取部分蛋白行10% SDS-PAGE，采用半干转电转移法将凝胶中蛋白转至硝酸纤维素膜。转膜后将硝酸纤维素膜置于5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入TGF-β1、NF-κB p65一抗(工作液浓度分别为1∶100、1∶750)，4 ℃孵育过夜，ECL显色。凝胶成像系统扫描分析，PhotoshopCS5.0软件检测各组条带灰度值，以GAPDH作为内参，计算TGF-β1蛋白相对表达量；以β-actin、LaminB1作为内参，分别计算NF-κB p65及核因子κB 抑制蛋白α(IκBα)蛋白相对表达量。实验重复3次，结果取平均值。结果显示，与对照组和空白组比较，miR-146a过表达组TGF-β1、IκBα蛋白相对表达量均降低(P<0.05)，NF-κB p65蛋白相对表达量增高(P<0.05)，而空白组与对照组比较P>0.05。见表1。

表1 三组TGF-β1、NF-κB p65及IκBα蛋白相对表达量比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，△P<0.05。

3 讨论

肺成纤维细胞活化是肺纤维化发生和发展过程中的核心环节和关键步骤[5]。当肺成纤维细胞受到致纤维化因子刺激时，其表型发生转化，转化为肌成纤维细胞，后者可表达α-SMA，合成大量胶原，细胞外基质合成增多、降解减少导致异常沉积，诱导肺泡上皮细胞发生凋亡，促进肺纤维化的发生和发展[6～8]。TGF-β1是肺纤维化进程中的关键性细胞因子，是纤维化发生与发展的启动因子，能启动成纤维细胞的增殖和分裂过程[9]；TGF-β1还能促进成纤维细胞转化为肌成纤维细胞[10]，并分泌大量细胞外基质及胶原，诱导肺纤维化的发生及发展[11]。研究证实，TGF-β1的合成受NF-κB调控[12]。NF-κB属于真核细胞核转录因子家族成员，p65是其主要的功能亚单位[13]。NF-κB在非活化状态存在于细胞质中，与多种基因启动子或增强子部位的κB位点特异性结合后被活化，其活化后发生核转位，从细胞质转移至细胞核，参与TGF-β1合成[14]。IκBα是NF-κB的负性调节剂，增加IκBα的合成或抑制其降解可抑制NF-κB活性[15]。通过采用腺病毒携带IκB基因转染呼吸道上皮细胞，可促进细胞表达IκB，抑制NF-κB活化，调节TGF-β1分泌[16]。

miRNA是一类小分子编码RNA，通过使靶基因降解或阻止其翻译转录负向调控或沉默靶基因表达。研究发现，miR-146a参与炎症调节并在固有免疫中发挥作用[17,18]，其与系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、银屑病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等多种自身免疫性疾病的发生、发展相关。在纤维化方面的研究中也发现，通过注射外源性miR-146a后可通过抑制促纤维化因子释放和炎症通路激活抑制肾纤维化的发生、发展[19]。有研究还发现，miR-146a还可通过作用于肝星状细胞的TGF/Smad和LPS/NF-κB/Bambi信号通路阻断肝纤维化进程[20]。

本研究结果显示，模型组miR-146a相对表达量明显低于假手术组，提示miR-146a下调可促进肺纤维化的发生。为验证miR-146a下调在肺纤维化发生中的作用，我们制作了过表达miR-146a的成纤维细胞模型并观察了其细胞增殖及NF-κB信号通路相关因子表达情况，结果显示，miR-146a过表达组细胞增殖率明显低于对照组及空白组，TGF-β1及IκBα蛋白表达明显低于对照组及空白组，NF-κB p65蛋白表达明显高于对照组及空白组。进一步证实miR-146a对肺成纤维细胞增殖有抑制作用。其抑制成纤维细胞增殖的机制可能为：miR-146a 3′端启动子区域存在多个核转录因子NF-κB的结合位点[21]，TNF-α、IL-1等炎症相关因子作用于细胞后激活IκBα，发生磷酸化并脱离NF-κB后，使NF-κB的核定位信号区暴露，促进NF-κB磷酸化，使其向细胞核内转移，参与TGF-β1合成，同时诱导了miR-146a表达，上调的miR-146a则可负反馈调节抑制NF-κB信号通路，负性调控NF-κB活化，抑制其下游因子TGF-β1释放，从而调控细胞增殖程度。过表达miR-146a可导致NF-κB信号通路受抑制，核内转移减少，TGF-β1合成减少，从而抑制细胞增殖。

综上所述，肺纤维化小鼠肺组织miR-146a表达下调，其可通过阻止细胞内NF-κB核转位而抑制成纤维细胞增殖和分化，从而延缓肺纤维化的发生及进展。