弥漫性大B细胞淋巴瘤组织Livin和Caspase-3表达变化及意义

刘兆玉，葛金丽，周震沧，王玉兰，李强，李行

(遵义市第一人民医院，贵州遵义563002)

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤的最常见类型，多见于中老年人，以40～50岁居多。DLBCL是一类具有高度异质性的疾病，其在临床表现、组织形态学、免疫表型及遗传学特征等方面都具有明显异质性。目前DLBCL的发病原因和机制尚不完全清楚，临床上缺乏特异性诊断标志物，易误诊[1～3]。凋亡抑制蛋白(IAP)是一类重要的细胞凋亡抑制因子，与多种肿瘤的发生、发展密切相关[4，5]。Livin是IAP家族中的新成员，是从人类基因组cDNA库中由IAP同源序列克隆获得，可抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)死亡效应结构域活性[6]。Caspase家族引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节。Caspase-3属于Caspase家族成员之一，可通过调控细胞凋亡方式参与机体生理、病理过程，并与多种肿瘤的发生、发展密切相关。本研究观察了DLBCL患者病变淋巴组织Livin和Caspase-3表达变化，并探讨其在DLBCL发生、发展中的作用。现报告如下。

1 临床资料

选择2012年1月～2017年3月遵义市第一人民医院收治的DLBCL患者69例(DLBCL组)。所有患者经组织病理检查明确诊断，入院前未行任何抗肿瘤治疗，排除合并其他影响本研究检测结果的疾病者以及临床病理资料或随访资料不完整者。其中，男38例、女31例，年龄25～78(59.32±13.57)岁；首发部位：淋巴结内35例，淋巴结外34例；病理类型：生发中心B细胞(GCB)型17例，非GCB型52例；Ann Arbor分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期11例，Ⅲ期41例，Ⅳ期8例。选择同期遵义市第一人民医院收治的反应性增生性淋巴结炎(RHL)患者30例(RHL组)，男17例、女13例，年龄31～74(60.13±9.22)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经遵义市第一人民医院医学伦理委员会批准，患者或其家属均知情同意。

2 方法与结果

2.2 病变淋巴组织Livin、Caspase-3表达检测 采用免疫组化Elivision法。取两组病变淋巴组织标本，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。切片常规脱蜡、水化，置于柠檬酸缓冲液中95 ℃热抗原修复10 min，自然冷却至室温。PBS冲洗3 min×3次，滴加兔抗人Livin多克隆抗体、兔抗人Caspase-3多克隆抗体，4 ℃孵育过夜。次日，PBS冲洗3 min×3次，滴加Elivision试剂盒试剂A(聚合物增强剂)，室温孵育20 min。滴加Elivision试剂盒试剂B(酶标抗兔IgG聚合物)，室温孵育30 min。最后DAB显色，苏木素复染，常规梯度乙醇脱水，中性树胶封片。采用双盲法由两位病理科高年资医师独立阅片，结果不一致时，由上级医师判定。结果判定采用半定量评分法。随机选取4个400倍视野，观察每视野染色强度并计数阳性细胞比例。Livin、Caspase-3阳性染色均定位于细胞核、细胞质，呈棕黄色颗粒。染色强度计分：不着色为0分，浅黄色为1分，黄棕色为2分，褐色为3分；阳性细胞所占比例计分：≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～75%为2分，>75%为3分。以染色强度计分和阳性细胞所占比例计分综合判定Livin、Caspase-3阳性表达，二者计分乘积>3分为阳性表达。结果显示，DLBCL组与RHL组病变淋巴组织Livin阳性表达率分别为57.97%(40/69)、0，Caspase-3阳性表达率分别为24.64%(17/69)、86.67%(26/30)。DLBCL组病变淋巴组织Livin、Caspase-3阳性表达率均高于RHL组(χ2分别为29.182、32.745，P均<0.01)。

2.3 DLBCL病变淋巴组织Livin、Caspase-3阳性表达与患者临床病理参数的关系 GCB型DLBCL患者病变淋巴组织Livin阳性表达率低于非GCB型者，Caspase-3阳性表达率高于非GCB型者(P均<0.01)；Ann Arbor分期Ⅰ、Ⅱ期者病变淋巴组织Livin阳性表达率低于Ⅲ、Ⅳ期者， Caspase-3阳性表达率高于Ⅲ、Ⅳ期者(P均<0.05)；Livin、Caspase-3阳性表达与患者年龄、性别、首发部位均无关(P均>0.05)。见表1。

2.4 DLBCL病变淋巴组织Livin阳性表达与Caspase-3阳性表达的关系 DLBCL病变淋巴组织Livin阳性表达与Caspase-3阳性表达呈负相关关系(r=-0.308，P<0.01)。

表1 DLBCL病变淋巴组织Livin、Caspase-3阳性表达与患者临床病理参数的关系[例(%)]

2.5 DLBCL病变淋巴组织Livin、Caspase-3表达与患者预后的关系 患者出院后通过电话、门诊等方式随访，随访截至2017年12月，随访时间9～62(36.13±14.14)个月，中位随访时间33个月。DLBCL病变淋巴组织Livin阴性表达者与阳性表达者生存率分别为86.21%(25/29)、42.50%(17/40)，生存时间分别为(52.14±2.65)、(42.50±2.74)个月；DLBCL病变淋巴组织Livin阴性表达者生存率和生存时间均高于Livin阳性表达者(P均<0.01)。DLBCL病变淋巴组织Caspase-3阴性表达者与阳性表达者生存率分别为51.92%(27/52)、88.24%(15/17)，生存时间分别为(44.71±2.48)、(50.18±3.09)个月；DLBCL病变淋巴组织Caspase-3阳性表达者生存率和生存时间均高于Caspase-3阴性表达者(P均<0.01)。

3 讨论

Livin定位于染色体20q13.3，具有两种异构体，分别为Livin-α、Livin-β，其cDNA长度分别为897、843 bp，二者分布虽有一定差异，但总体上变化不大[6，7]。正常成人机体中Livin只表达于胚胎及胎盘组织，未见于其他组织。近年研究发现，多种肿瘤组织中可见Livin阳性表达。如在中晚期直肠癌组织中Livin异常高表达，且其阳性表达者预后较差[8]；在乳腺癌组织中Livin异常高表达，且通过p38/GSK3β信号通路促进乳腺癌的进展与转移，Livin高表达者预后较Livin低表达者差[9]。在关于人肺腺癌组织及A549细胞的联合研究中发现，肺腺癌组织Livin异常高表达，经相关微小RNA沉默Livin表达的肺腺癌A549细胞增殖减少、凋亡增加[10]。说明Livin可能与肿瘤的发生、发展有关。本研究结果显示，在DLBCL病变淋巴组织中Livin阳性表达率明显升高，且其阳性表达与Ann Arbor分期密切相关，进一步证实Livin参与了DLBCL的发生、发展过程。GCB型DLBCL患者病变淋巴组织Livin阳性表达率显著低于非GCB型者，提示Livin与DLBCL的起源有关。

目前认为，Livin抑制细胞凋亡主要通过两个途径，即激活TAK1/JNK1信号通路[11]、抑制Caspase途径[12]。Caspase家族引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节。Caspase-3属于Caspase家族成员之一，是细胞凋亡过程中的下游效应蛋白，其编码基因定位于染色体4q32-35.1，主要表达于人体细胞胞质部位，但细胞核中亦可表达[13]。机体细胞内的Caspase-3以酶原形式存在，当细胞进入内源性或外源性凋亡途径，Caspase-3即会被激活，因而可将Caspase-3视为细胞凋亡的标志因子[14]。Caspase-3通过调控细胞凋亡不仅参与机体生理、病理过程，还与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。Li等[15]研究发现，口腔鳞癌组织Caspase-3表达明显低于正常组织，且随着肿瘤的恶性进展，Caspase-3表达进一步降低。Yusuf等[16]报道，在结直肠癌组织中Caspase-3表达明显降低，且其低表达者预后较差。本研究结果显示，DLBCL病变淋巴组织Caspase-3阳性表达率明显降低，且其表达与患者Ann Arbor分期有关。说明DLBCL的发生、发展可能与Caspase-3表达受抑制有关。

Gu等[17]研究发现，前列腺癌组织Livin表达与Caspase-3表达呈负相关关系。Li等[18]研究发现，应用替莫唑胺的人神经胶质瘤U251细胞Livin表达下降，同时Caspase-3表达上升，二者表达同样呈负相关关系。本研究结果显示，DLBCL病变淋巴组织Livin阳性表达与Caspase-3阳性表达亦呈负相关关系，提示Livin、Caspase-3在DLBCL中的效应可能与前述组织中类似，即二者具有拮抗作用。本研究随访结果显示，DLBCL病变淋巴组织Livin阳性表达者生存率低于Livin阴性表达者，生存时间短于Livin阴性表达者；DLBCL病变淋巴组织Caspase-3阴性表达者生存率低于Caspase-3阳性表达者、生存时间短于Caspase-3阳性表达者。提示Livin阳性表达及Caspase-3阴性表达的DLBCL患者预后不良。

综上，DLBCL病变淋巴组织Livin表达上调、Caspase-3表达下调，二者表达变化可能参与DLBCL的发生、发展，并与患者不良预后密切相关。