长链非编码RNA GC lnc1对胃癌MGC-803细胞增殖和迁移的作用

任瑞平，张昱，袁祖国

（宁波市鄞州人民医院，浙江 宁波 315040）

长链非编码RNA（Lnc RNA）被认为可以调节癌细胞的生长、凋亡和转移[1]。研究证明，Lnc RNAs、HOTAIR、MEG3、MALAT1、H19 和 GAPLINC 与 胃癌的发病和发展密切相关[2-6]。然而尚无研究涉及Lnc RNA GC lnc1在胃癌中的发病机制。本研究利用慢病毒转染技术构建Lnc RNA GC lnc1的干扰载体，探究Lnc RNA GC lnc1对胃癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清购自Gibco公司；DMEM及0.25%胰酶Trypsin购自美国Invitrogen公司；TRIZOL购自美国Invitrogen公司；氯仿、酒精（浓度为75%）及逆转录试剂盒购自美国ABI Applied Biosystems公司；Real-time PCR仪购自美国biorad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胃癌细胞系MGC-803的培养 培养人胃癌细胞系MGC-803为靶点种子细胞，购自中科院上海细胞研究院。经离心收集后，以2×104/cm2的密度将其种植于25cm×25cm的培养瓶中。加入含10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液 （Gibco-BRL，Gaithersburg，MD）进行培养。

1.2.2 构建Lnc RNA GC lnc1的过表达载体Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干扰载体由上海吉凯公司合成，选择pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作为质粒的克隆载体。慢病毒RNAi干扰载体的克隆切入点是XhoI/BamHI，编号为ENST00000003424。经过基因测序证明序列的正确性。

1.2.3 胃癌细胞的分组与干预措施 将胃癌细胞分成3组，即空白对照组、空白病毒载体对照组和RNAi干扰载体组。空白对照组是未做任何处理的细胞，空白病毒载体对照组是经空白载体的慢病毒转染的细胞组，RNAi干扰载体组是由Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干扰载体构建的慢病毒转染细胞。以ZsGreen为慢病毒荧光探针，用荧光显微镜观察细胞慢病毒的转染效率。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 三组细胞融合率达80%，0.25%胰蛋白酶消化后放入15mL离心管，加入 1mL 的 Trizol RNA iso （Takara，日本），提取总RNA，根据Takara逆转录试剂盒说明书，检测总RNA的纯度为1.9～2.0。逆转录cDNA保存在4℃冰箱中备用。根据TaKaRa荧光定量PCR试剂盒的说明书要求，采用20μL的反应体系，加入各样品，进行荧光定量PCR的检测。采用FS2000系统对PCR进行分析，反应条件预设为预变性：95℃30秒，1个循环。 PCR：95℃ 5秒，60℃ 30秒，40个循环。溶解曲线：95℃5秒，60℃ 1分钟。降温：50℃30秒，1个循环。内参基因GAPDH和凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9引物由上海生工公司生产（表1）。采用2-△△CT的方法计算目的基因的相对表达量。

表1 目的基因的引物序列

1.2.5 Transwell小室实验检测肿瘤细胞的迁移三组细胞经胰蛋白酶消化后收集，按照试剂盒的说明书，将基底膜的基质原液放在冷藏冰箱（4℃）过夜融化，然后与预冷的无血清RPMI-1640按照1:3的比例配置侵袭上室凝胶液体，以每孔55μL量包被Transwell小室的上室，放置在37℃的孵育箱，2小时后使上室成胶。然后上室每孔接种200μL不含血清的细胞培养液，下室加入10%胎牛血清的RPMI-1640培养液500μL。将Transwell板放置在37℃的孵育箱中培养24小时后用结晶紫染色，再将Transwell板用倒置光学显微镜拍照并且进行细胞计数。所有实验均重复3次。

1.2.6 CCK-8实验检测肿瘤细胞的增殖 三组细胞经胰蛋白酶消化后收集，按照CCK-8试剂盒说明书[16]将三组转染后的细胞接种在96孔板中，转染细胞以每孔5000个/100μL接种，72小时后每孔加入10μL CCK-8的试剂，放至37℃的孵育箱中培养2小时。然后用酶标仪在450nm波长处测定吸光度。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0软件进行统计学处理，结果用±s）形式表示。多组间计量资料采用方差分析，两组间比较再采用q检验。

2 结果

2.1 Lnc RNA GC lnc1的慢病毒RNAi干扰载体的构建和转染 以ZsGreen为荧光蛋白为荧光探针，Lnc RNA GC lnc1慢病毒转染效率较高，以胃癌MGC-803细胞为靶点种子细胞，慢病毒转染率为94%，Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干扰载体的滴度为1×108TU/mL。详见图1。

图1 Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干扰载体的构建和转染。1A：0.11μL慢病毒转染胃癌MGC-803细胞的荧光下视野；1B：0.033μL慢病毒转染胃癌MGC-803细胞的荧光下视野；1C：0.11μL慢病毒转染胃癌MGC-803细胞的白光下视野；1D：0.033μL慢病毒转染胃癌MGC-803细胞的白光下视野。

2.2 凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的表达RT-qPCR检测三组间凋亡基因Caspase-3，Caspase-9的表达水平，差异均有统计学意义 （F=17.927，P＜0.05 和 F=15.117，P＜0.05）。 同时，Caspase-3、Caspase-9两个指标，RNAi干扰载体组与空白对照组、与空白载体病毒组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。 详见表 2。

表2 三组Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达水平（±s）

表2 三组Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达水平（±s）

与空白对照组、与空白载体病毒组比较*P＜0.05

组别 n Caspase-3 Caspase-9空白对照组 3 1.001±0.002 1.001±0.003空白载体病毒组 3 1.231±0.112 1.112±0.007 RNAi干扰载体组 3 2.247±0.729* 3.047±0.432*

2.3 细胞的迁移和增殖 Transwell实验结果显示，透过分子筛的细胞数三组之间比较差异有统计学意义（F=31.982，P＜0.01），其中 RNAi干扰载体组与空白对照组、与空白载体病毒组比较透过分子筛的细胞数显著降低，差异具有统计学意义 （均P＜0.05）。CCK-8检测结果显示，三组细胞增殖率差异有统计学意义（F=23.983，P＜0.05），其中 RNAi干扰载体组与空白对照组、与空白载体病毒组比较细胞增值率显著降低，差异具有统计学意义 （均P＜0.05）。 详见表 3。

表3 三组细胞增殖率比较

3 讨论

非编码RNA（Lnc RNA）本身不具有编码蛋白，是不具有转录功能的RNA分子，长度不超过200个片段[7]。更重要的是，Lnc RNAs已经被证实在肿瘤细胞的发生和发展、增殖和侵袭中起重要的作用[8]。既往研究表明，Lnc RNA在肺癌、前列腺癌、结肠癌和肝癌等肿瘤细胞中具有重要的转录因子作用[9]，并且与肿瘤的大小和临床分期密切相关[10-12]。本研究主要探讨Lnc RNA GC lnc1在胃癌细胞的增殖侵袭和凋亡中的作用。

Caspase家族是近年来细胞凋亡领域中分子生物学研究的重要发现之一，在凋亡的最后阶段是通过Caspase家族的激活和表达而实现的[13]，其中Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族中与凋亡密切相关的蛋白酶，并且与胃癌细胞的凋亡有密切关系[14-15]。

本研究通过RT-qPCR方法检测了Lnc RNA GC lnc1在胃癌细胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平的表达，发现RNAi干扰载体组与空白对照组、与空白载体病毒组比较均显著升高（均 P＜0.05），提示 Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干扰载体可促进胃癌细胞的凋亡。

通过Transwell实验发现，RNAi干扰载体组与空白对照组、与空白载体病毒组比较，透过分子筛的细胞数显著降低（均P＜0.05），说明Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干扰载体在胃癌细胞的迁移中具有明显的抑制作用。

此外，本研究还利用CCK-8实验检测肿瘤细胞的增殖，结果显示RNAi干扰载体组与空白对照组、与空白载体病毒组比较细胞增殖率显著降低（均P＜0.05）。从而说明Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干扰载体在胃癌细胞的增殖中具有明显的抑制作用。

综上，Lnc RNA GC lnc1慢病毒RNAi干扰载体在胃癌细胞的过度凋亡具有明显的促进作用，对肿瘤细胞的迁移和增殖具有明显的抑制作用，但具体起作用的分子生物学机制需进一步研究。