干姜附子肉桂汤诱导口腔溃疡的机制研究

浙江中医药大学 杭州 310053

上火是指因精神紧张、过度劳累、辛热药食等引起的[1]，以人体头面部口、舌、牙龈、咽喉、眼、鼻等部位皮肤黏膜出现红肿热痛、溃疡症状为主要特征，并可伴有全身症状、反应的一种轻微易反复的疾病[2]。上火症状虽有一定自限性，但严重者亦会变生其它病证。现代社会由于饮食结构的变化和竞争的日益加剧，上火的发病率呈明显上升趋势，但目前对上火的病理生理机制还不是很清楚。

在上火的诸多症状中，口腔溃疡具有典型代表性，类似于中医的“口疳”“口疡”“口疮”，最早记载于《黄帝内经》，“岁金不及，炎火乃行……民病口疮”。将口疮的病因归于为“火”，由此可见口腔溃疡与“火”的关系密切。附子、肉桂、干姜是大辛大热之品，长期使用容易诱发口腔溃疡等上火症状。在前期研究中，课题组利用干姜附子肉桂煎剂建立了大鼠上火模型，通过对血清和尿液代谢的研究，笔者推断热性药可能通过导致机体上火进而诱发口腔溃疡。因此本课题以口腔溃疡为切入点，通过干姜附子肉桂汤建立上火的大鼠模型，进一步探讨上火的发病机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠20只，6～8周龄，体质量（150±20）g，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016]，饲养于浙江中医药大学动物实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠均在全封闭清洁级状态下隔离饲养，室温20℃，相对湿度40%～60%，每日光照12h，自由摄食、饮水。

1.2 药品与试剂 淡附片、干姜、肉桂均由浙江中医药大学中药饮片厂提供。HE染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司（批号：C0105）；HRP标记的抗大鼠IgG抗体和抗大鼠IgA抗体购自北京博奥森公司（批号：bs-0293R-HRP、bs-10491R-HRP）；RNA 试剂盒购自德国Qiagen公司(批号：74104)；基因芯片由上海康成生物工程有限公司制备（L Series 90:RayBio Label-based Rat Antibody Array，AAR-BLM-1-2）。

1.3 主要仪器及软件 Histocentres包埋机、HM 300E石蜡切片机均购自美国Thermo Scientific公司；光学显微镜购自德国Zeiss公司；安捷伦微阵列芯片扫描仪购自美国Agilent公司。

1.4 方法

1.4.1 药品制备 称取淡附片、干姜、肉桂各200g，以单蒸水800mL煎煮1h，共煎煮2次，然后将2次的中药水煎剂混合，再以R202型旋转蒸发器将其浓缩成1g·mL-1。中药水煎剂大鼠灌胃量估算如下，首先以60kg体重的成人干姜附子肉桂汤药物使用量代入公式，然后结合大鼠的体重，以下述公式换算出大鼠每日最大中药煎剂的灌胃量，计算公式如下：K鼠/K人为人和小鼠间按体表面积换算的等效剂量比值。

1.4.2 动物分组及给药 将20只健康SD大鼠用完全随机法分为两组：对照组和模型组，每组各10只。两组大鼠均以普通饲料喂养，其中对照组给予0.9%氯化钠溶液0.1mL/（10g·d）灌胃；模型组给予1g·mL-1干姜附子肉桂水煎剂0.1mL/（10g·d）灌胃，均为1次/d，连续21d，观察大鼠状态。

1.4.3 样品采集 灌胃第21天，以10%水合氯醛麻醉大鼠，剂量为0.33mL/100g，麻醉后腹主动脉取血1mL，委托浙江中医药大学动物实验中心进行血常规检测。用吸头卡住大鼠两侧口角，令其开口，剪刀剪取口腔黏膜组织，一部分以10%中性甲醛溶液固定，用于病理切片HE染色和免疫组化检测，另一部分以PBS清洗后-80℃冻存，用于基因芯片检测。

1.4.4 HE染色观察口腔黏膜组织病理变化 取大鼠口腔黏膜组织，10%中性甲醛溶液固定后，脱水、包埋、HE染色试剂盒染色，用病理切片扫描仪扫描切片，观察口腔黏膜组织病理变化。

1.4.5 免疫组化检测口腔黏膜组织IgG和IgA的表达 取口腔黏膜组织，10%中性甲醛溶液固定后，脱水、包埋、烤片、脱蜡、抗体孵育、DAB显色液显色、染色、封片，400倍光学显微镜下观察。

1.4.6 基因芯片的检测与分析 两组各取4只大鼠的口腔黏膜组织。实验采用全基因表达谱（the Whole Genome Oligo Array，4x44K，Agilent Technologies），阵列由Agilent Scanner G2505C扫描，获得的阵列图像通 过 AgilentFeature Extraction Software（version 11.0.1.1）进行分析。后期基因芯片数据分析包括原始数据归一化分析、基因表达分析、差异基因筛选、差异基因的GO富集分析和KEGG Pathway分析等。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间差异比较用独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。基因芯片结果的原始数据用软件 Agilent Feature Extraction Software（v11.0.1.1）归一化，后续数据处理通过Agilent GeneSpring GX（v12.1）进行，最后通过Volcano Plot筛选差异性表达基因。以Ratio值＞1.5，表达差异倍数（fold change，FC）≥2.0，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠基本状态比较 灌胃过程中和灌胃后，两组大鼠均无死亡。灌胃21d后，与对照组比较，模型组大鼠皮毛粗糙、舌质暗红，并且行动更加频繁，难以捕捉。

2.2 两组大鼠血常规检测结果比较 灌胃21d后，对照组大鼠的白细胞（white blood cell，WBC）计数、中性粒细胞（neutrophil，NEUT）、淋巴细胞（lymphocyte，Lymph）计数和中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophils-lymphocyte ratio，NLR），与灌胃前比较，略微降低，单核细胞（monocyte，MONO）计数略有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组以干姜肉桂附子汤灌胃 21d后，WBC、NEUT、MONO 计数、NLR 均升高，其中NEUT、NLR和MONO升高明显，与灌胃前比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），Lymph稍有降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组大鼠血常规检测结果（±s）Tab.1 The results of blood routine examination in two groups(±s）

表1 两组大鼠血常规检测结果（±s）Tab.1 The results of blood routine examination in two groups(±s）

注：与模型组灌胃前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with model group before intragastric administration,*P＜0.05,**P＜0.01.

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2.3 两组大鼠口腔黏膜病理学检测比较 与对照组比较，模型组大鼠口腔黏膜组织发生表皮脱落、炎性浸润的现象。见图1。

图1 大鼠口腔黏膜病理学检测（HE染色）Fig.1 HE staining of oral mucosa in rats(HE staining)

2.4 两组大鼠口腔黏膜IgG和IgA表达比较 IgG染色和IgA染色显示，与对照组比较，模型组大鼠的口腔黏膜组织均表现出角化层与颗粒层变薄收缩的现象。IgG染色显示，模型组的口腔黏膜组织棘层与基底层IgG阳性表达细胞多于对照组。见图2。IgA染色显示，模型组棘层与基底层中IgA阳性表达细胞多于对照组，见图3。

2.5 基因芯片检测结果

2.5.1 差异基因筛选 结果显示模型组与对照组的口腔黏膜组织基因存在显著差异。模型组与对照组相比较发现463个差异表达基因，模型组中有299个基因表达高于对照组，164个基因表达低于对照组。见图4。红点代表具有统计学意义差异表达的基因，垂直线代表P值，水平线代表差异倍数变化。

图2 两组大鼠口腔黏膜免疫组化IgG染色结果（400×）Fig.2 The results of IgG immunohistochemical staining in two groups(400×)

图3 两组大鼠口腔黏膜免疫组化IgA染色结果（400×）Fig.3 The results of IgA immunohistochemical staining in two groups(400×)

2.5.2 差异基因KEGG信号通路分析和GO富集分析 根据最新的（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库和GO分析，对差异表达基因进行分析。结果显示模型组与对照组的差异表达基因主要与代谢、细胞内蛋白激酶级联反应、甘油三酯（triglyceride,TAG）的生物合成、细胞黏附、细胞信号转导等功能密切相关。信号通路分析显示，差异基因主要涉及脂肪的消化与吸收、类固醇生物合成、细胞外基质-受体相互作用（extracellular matrix-receptor interaction,ECM-receptor interaction）、黏着斑通路、缺氧诱导因子-1信号通路（hypoxia-inducible factors-1 signalingpathway， HIF-1 signalingpathway）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路（phosphatidylinositol 3'-kinase-protein kinase B signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway）等。上调与下调的信号通路见图5。其中主要信号通路及主要差异基因见表2，表3则是表2中差异基因的概括。

图4 差异基因火山图Fig.4 Volcano map of genes with significant differences

图5 差异表达基因的Pathway分析Fig.5 Pathway analysis of differentially expressed genes

表2 差异基因主要涉及的Pathway分析Tab.2 Main Pathway analysis of differential genes

表3 主要通路中的基因分析Tab.3 Gene analysis in the main pathway

3 讨论

上火属于传统的中医学俗语，一般指体内阴阳失衡导致的目赤、咽痛、口干、口腔溃疡、牙龈肿痛、便秘、尿赤等临床表现，虽然现代医学并无与上火相对应的疾病诊断，但是上火在临床上是一种常见的综合征，而且与饮食、劳倦、气候有关[2]。清代《王九峰医案·咳嗽》中云：“咳嗽气喘，胸中气急且闷，多食不舒，甚则头面上火。”[3]指出上火的好发部位在头面部，并多表现为头面部的黏膜损伤性病变[2]，而口腔溃疡正是其中的典型代表。

热性中药辛热燥烈，易耗阴动火，过服会耗伤阴津，阴液不足则诱发虚热证[4]。干姜附子肉桂汤作为热性药中具有代表性的一个方子，临床经验提示，长期使用易诱发口腔溃疡等上火症状。1987～1989年用此复方制造的热证动物模型研究证明，附子、干姜、肉桂三药合用对大鼠有增强代谢功能和增加耗氧量的作用[5]。后期进一步研究表明，附子、干姜、肉桂灌胃的大鼠可以选作为热证模型[6]。本研究中，利用干姜附子肉桂汤灌胃建立了上火大鼠模型，该模型大鼠表现出了上火的一系列症状，采用基因芯片技术检测上火大鼠口腔黏膜组织发现，干姜附子肉桂汤灌胃的大鼠其多种基因水平发生改变，这可能是上火引发口腔溃疡的机制之一。

经干姜肉桂附子汤灌胃21d后，血常规检测结果显示，模型组大鼠的WBC、NEUT、MONO、NLR均升高。其中NLR是系统炎性反应的评价指标，反映炎症激活因子和免疫调节因子之间的平衡状态，NLR升高反映机体炎性反应激活和免疫能力低下[7]。因此血常规结果提示模型组大鼠可能出现上火现象，并有炎症倾向。有研究表明口腔溃疡早期可见毛细血管明显扩张、充血，随后血管周围和黏膜下出现淋巴细胞密集浸润，同时中性粒细胞散在浸润，最终出现黏膜溃破[8]。HE染色结果显示模型组大鼠的口腔黏膜组织发生表皮脱落、炎性浸润，角化层与颗粒层出现变薄收缩，提示大鼠的口腔黏膜组织有一定的损伤。同时，免疫组化的结果显示模型组口腔黏膜组织的IgG和IgA的表达均升高，表明模型组的口腔黏膜组织出现了炎症反应。以上结果表明模型组大鼠已经上火并诱发了口腔溃疡，造模成功。

利用基因芯片技术人们不但可以对很多基因的功能进行研究，同时还可以利用整体研究的特色从基因层次对疾病精确分类[9]。基因芯片技术分析结果显示，对照组与模型组的口腔黏膜组织在代谢、细胞黏附等方面的基因表达存在较大差异。虽然基因芯片得出较多差异基因，本文结合通路分析，选择了与本研究相关性最强，而且FC相对较高的两个基因进行重点讨论。在脂肪的消化与吸收相关基因中，与对照组相比，模型组二脂酰甘油酰基转移酶2（acyl CoA：diacylgycerol acyltransferase 2，DGAT2）表达升高。DGAT2是一种完整的内质网微粒体酶，是催化TAG合成最后一步反应的酶，也是TAG合成过程中唯一的关键酶和限速酶[10-11]。DGAT2在脂质代谢中扮演着十分重要的角色，是脂肪合成的限速酶[12-13]，其催化产生的TAG是真核生物中性脂类的主要贮存形式[14-15]。TAG在绝大多数植物和动物体内是最重要的脂类贮藏形式[16]，在营养缺乏和应激时提供能量[17]。在上火的一系列症状中如口疮、牙宣等都是以头面部黏膜损伤为主，而导致黏膜免疫系统异常的主要原因就是能量代谢紊乱。本实验中模型组大鼠口腔黏膜组织中DGAT2基因表达水平相对升高，说明模型组大鼠口腔黏膜组织的脂质代谢水平受到影响。

ECM受体相互作用和黏着斑通路相关基因中，模型组的Ⅺ型胶原α2（collagen typeⅪ alpha-2，COL11A2）基因表达低于对照组。胶原蛋白是蛋白质的一种，是ECM的主要成分[18]。细胞通过ECM的黏附作用能够动态地感知周围环境的变化[19]。ECM能够维持正常细胞的结构和功能，其合成和代谢不平衡会引起基质硬度的变化，特别是蛋白质的大量堆积容易导致ECM物理硬度发生变化[20]，进而影响黏着斑的形成和细胞的黏附作用，而细胞黏附作用的改变会造成细胞一系列生物学功能的改变[21]。模型组大鼠的口腔黏膜组织中的COL11A2表达降低，从而影响了ECM受体相互作用及黏着斑的形成，造成ECM合成和代谢的不平衡，影响了ECM对细胞的保护作用。

基因芯片结果说明模型组大鼠脂肪的消化和吸收增强，ECM受体相互作用和黏着斑的形成受阻，从而对口腔黏膜组织的外层保护作用降低，同时伴有一些基础转录因子表达增强，以上综合因素可能是上火引起的口腔溃疡发作的原因。本研究利用基因芯片的方法，通过对上火模型大鼠的口腔黏膜组织进行研究，找出了其中的差异表达基因，为热性药引起的机体上火的发病机制提供了实验依据。运用现代多学科的技术方法，开展上火发病机制的研究，有助于揭示其科学内涵，丰富中医学理论，对预防相关疾病的发生和促进中医理论的现代化也具有重要意义。