“上火”人群的肠道微生物结构特征研究

浙江中医药大学基础医学院中医临床基础研究所 杭州 310053

“上火”是中医学上特有的病名，属于“火热证”范畴。调查显示在中国91%的成年人有过“上火”经历[1]。“上火”症状表现形式多样，包括口腔溃疡、牙龈红肿、唇周面部疱疹、双目红赤、口干眼干、尿赤、便秘等。现代医学把“上火”视为“亚健康”状态和代偿范围内的急性应激反应，是免疫功能下降时出现的炎症和局部感染[2]。现代医学对“上火”相关病证的研究发现，其发病多与环境、饮食、情志、遗传、免疫、微生物等因素相关[3]。

情志刺激、过食辛辣燥热、劳累过度和微生物感染等因素可引起体内微环境变化，导致黏膜上皮组织的糖酵解功能活跃，从而导致能量代谢紊乱，进一步引起黏膜损伤，使黏膜免疫系统中Th17/Treg细胞比例上调，分泌型免疫球蛋白A（immunoglobulin A,I－gA）分泌减少，局部黏膜免疫力下降，易继发感染，进而加重黏膜损伤[4]。因此，“上火”人群中普遍存在着体内能量代谢的紊乱及黏膜免疫的异常。

近年来，研究证实肠道微生物在机体能量代谢和黏膜免疫方面发挥重要作用[5-6]。肠道微生物通过多条途径参与机体的能量代谢，包括对不能被人体细胞消化的膳食纤维进行酵解、对肽类或蛋白质进行无氧酵解、胆汁酸的生物转化和草酸盐复合物的降解等[7]。另外，肠道菌群可通过在肠道中定植，构建肠道免疫屏障；肠道细菌在死亡或增殖时，不断向外界释放脂多糖、肽聚糖或磷脂壁酸等刺激物，这些物质进入血液，从而引起全身黏膜免疫反应[6]。综上所述，肠道菌群可通过影响能量代谢和黏膜免疫，参与“上火”的发生。

为明确“上火”人群的肠道菌群结构特征，本研究采用Illumina MiSeq测序技术检测“上火”人群和健康人群的肠道菌群结构，进一步了解“上火”相关的肠道菌群种类的变化。

1 材料和方法

1.1 样本来源 样本采集时间为2016年8月至2017年5月,采集对象为浙江中医药大学全日制各专业在读本科生。所有研究对象均自愿加入“上火”项目研究，均符合相应的中医诊断标准、“上火”人群和健康人群的纳入标准及排除标准。

1.2 诊断标准、纳入标准和排除标准

1.2.1“上火”人群诊断标准 采用专家咨询法，确定“上火”的诊断标准：1个主症（头面部症状）或2个次症（至少1个为头面部症状）。主症：牙龈肿痛、咽喉肿痛、口臭、口腔溃疡、鼻疮疖、热疮（颜面部疱疹）、口苦和目赤干涩。次症：口角糜烂、目眵增多、口渴、舌痛、痤疮、鼻腔干燥、齿衄、鼻衄、声音嘶哑、头痛、大便干结、小便黄、心烦、五心烦热、多食易饥、痔疮发作、潮热和失眠。

1.2.2 健康人群入选标准 正常对照组为健康的大学生，近半年内无“上火”病史（根据前文提到的“上火”诊断标准），无心脑血管病史及其他重大内科疾病史，无结核、伤寒或肝炎等传染病史；三大常规、肝肾功能、胸片、B超、心电图等指标无明显异常；体格检查无明显异常；近1个月内无腹泻或胃肠病史，无用药及服用微生态制剂史；无吸烟、饮酒等不良嗜好；舌质淡红，苔薄白，脉象正常。

1.2.3 纳入标准 （1）符合“上火”的诊断标准；（2）符合上述标准的健康体检者；（3）年龄18～35岁；（4）自愿参加本实验并签署临床研究知情同意书。

1.2.4 排除标准 （1）由于抗生素、激素等药物的使用引起“上火”表现者；（2）有重大内科疾病、消化道疾病者或精神疾病不能配合者；（3）妊娠或哺乳期妇女；（4）存在研究者认为不适合纳入的其他情况。

1.3 样本采集 样本采集前，采用调查问卷形式详细记录受试者的年龄、性别、身高、体质量、饮食习惯及饮食结构等特征，记录中医证候。粪便样本采集前，先排净小便，防止尿液污染粪便。用无菌一次性采样杯采集新鲜粪便样本后置于冰盒内，迅速将粪便运回实验室进行按20mg/管分装，随即置于-80℃冰箱中保存。

1.4 标本收集及检测

1.4.1 粪便DNA提取、扩增和测序 采用粪便DNA提取试剂盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（德国Qiagen公司产品，批号：51304）抽提粪便DNA。检查DNA浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测。合格后，采用16S rRNA基因的V3-V4区引物对基因组进行扩增。扩增引物上下游分别是上游5’-X-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’ 和 下 游 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，引物由Invitrogen公司合成，“X”为区别不同样本的8个随机组合的核苷酸碱基片段（barcode）。PCR扩增前，模板浓度统一稀释到 20ng·μL-1。扩增体系如下：5×反应缓冲液 5μL、5×GC 缓冲液 5μL、100mmol·L-1dNTP 5μL、10μmol·L-1上游引物 1μL、10μmol·L-1下游引物 1μL、DNA 模板2μL、ddH2O 6μL。反应总体系共 25μL。反应条件：初始变性 98℃ 2min，变性 98℃ 15s，退火 55℃ 30s，延伸72℃ 30s，共25个循环。72℃延伸5min，10℃保存。

PCR扩增产物质检合格后，进行文库构建，采用Illumina MiSeq测序平台进行250bp×2双末端测序；下机进行测序原始数据整理、过滤及质量评估；序列进行质控过滤后，接下来进行操作分类单元（operational taxonomic units,OTUs）列表生成及注释。

1.4.2 数据整理、过滤及质量评估 测序完成后，对原始数据进行处理，步骤如下：（1）采用滑动窗口法对双端的FASTQ序列进行质量过滤，截掉质量低的数据；（2）利用FLASH软件（v1.2.7）对通过质量初筛的双端序列根据重叠碱基进行配对连接，并根据barcode序列将序列拆分，各自回归到对应样品；（3）运用QIIME软件（v1.8.0）识别疑问序列，保留长度＞150bp和不存在模糊碱基N的序列，并调用USEARCH（v5.2.236）检查并剔除嵌合体序列，从而获得最后用于分析的序列。

1.4.3 多样性和群落结构分析 调用QIIME软件中的UCLUST程序，对获得的序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分，根据OTU在每个样本中所包含的序列数，构建OTU在各样本中丰度的矩阵文件。采用QIIME软件对样品序列进行Alpha多样性分析，包括ACE指数和Chao1指数，并采用SPSS 16.0统计软件进行两类人群间单因素方差分析。选择OTUs中的一条代表序列（默认丰度最高），采用Ribosomal数 据 库 （Ribosomaldatabase project，RDP）进行OTU分类地位鉴定。使用R软件，根据OTU丰度矩阵和样本分组数据构建PCoA分析，评估微生物群落的整体差异；根据OTU丰度矩阵表，使用在线分析软件LEfSe（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）分析健康人群与“上火”人群间差异的肠道菌群种类，线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）得分大于 2，且 Kruskall-Wallis检验值小于0.05即为差异显著。

2 结果

2.1 受试者临床样本信息统计分析 根据上述诊断、纳入及排除标准，共纳入35例“上火”人群，男女比例为0.84:1，平均年龄为24.4岁，平均体重指数（body mass index，BMI）为 23.2kg/m2。为匹配“上火”人群的样本信息，同时收集了健康人群35例，男女比例为0.67:1，平均年龄为23.7岁，平均BMI为22.3kg/m2。见表1。两组基本信息采用方差分析比较，结果显示组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 临床研究人群基本信息Tab.1 Basic information of clinical study population

2.2 两组受试者Alpha多样性指数比较分析 本研究采用Chao1和ACE两种Alpha多样性指数反映健康人群和“上火”人群的肠道菌群多样性。“上火”人群的肠道微生物多样性平均指数均低于健康人群，但两组之间无统计学差异（P＞0.05）。一般来说，Alpha多样性指数值越高，表明群落的多样性越高。因此，“上火”可能会导致肠道菌群多样性略微降低。见图1。

图1 健康人群与“上火”人群的Alpha多样性指数比较Fig.1 Comparison of Alpha indices between healthy and“Shanghuo”individuals

2.3 两组受试者Beta多样性比较分析 健康人群和“上火”人群的肠道菌群差异可以通过PCoA分析进行归类，PC1和PC2分别为12.94%和6.26%。两种人群在PCoA图上均能各自聚类，但有部分重叠，说明两类人群的肠道菌群Beta多样性具有差异。见图2。

2.4 健康人群与“上火”人群的差异肠道菌群分析图3展示了健康人群和“上火”人群之间的差异肠道菌群发育树图，由LEfSe在线分析程序获得，其中显著差异的logarithmic LDA score设为3。绿色节点代表健康人群高于“上火”人群的肠道菌群种类，红色节点代表“上火”人群显著高于健康人群的肠道菌群种类。

图2 基于OTU丰度矩阵表的PCoA判别分析Fig.2 PCoA analysis based on OTU abundance of gut microbiome individuals.

图3 健康人群与“上火”人群间差异肠道菌群的LEfSe分析Fig.3 LEfSe analysis reveals the significantly different gut microbiota between healthy and“Shanghuo”individuals

在微生物门水平上，健康人群与“上火”人群间显著差异的种类包括6个，分别是放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和迷踪菌门（Elusimicrobia），前三个门在“上火”人群肠道内含量显著上调，后三个门在“上火”人群肠道内含量显著下调。

在微生物属水平上，LEfSe共鉴定出13个属在两种人群中存在显著差异。在放线菌门（Firmicutes）中，包括8个显著差异属，分别是厌氧管状菌属A（Naerofustis）、布劳特菌属（Blautia）、栖粪杆菌属（Faecalibacterium）、颤螺菌属（Oscillospira）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、厌氧弧菌属（Anaerovibrio）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium） 和粪芽孢菌属（Coprobacillus），它们均在“上火”人群中显著上调。变形菌门（Proteobacteria）包括2个在“上火”人群肠道内显著上调的属，分别是固氮螺菌属（Azospirillum）和丛毛单胞菌属（Comamonas）。除了在“上火”人群中上调的微生物属，还包括“上火”人群中下调的微生物属，分别是拟杆菌门（Bacteroidetes）中的B拟杆菌属（Acteroides）和普氏菌属（Prevotella），及螺旋体门（Spirochaetes）中的密螺旋体属（Treponema）。在放线菌门（Actinobacteria）和迷踪菌门（Elusimicrobia）中未发现显著差异的属。

3 讨论

中医认为“上火”者体内会出现阴阳失衡、火热旺盛，导致能量代谢紊乱及黏膜免疫失调。肠道微生物可参与机体能量的产生、转化、储存和利用，并通过改变组织对能量的利用方式和AMP依赖的蛋白激酶（adenosine 5’monophosphate activated protein kinase，AMPK）磷酸化等途径来影响机体的能量代谢[8]；同时，肠道菌群可调控免疫效应因子，如sIgA的产生，以及模式识别受体如Toll样受体（toll-like receptor，TLR）等的活化，从而影响机体的肠道黏膜免疫[9]。因此，本研究结果揭示的“上火”人群肠道微生物的变化，有助于解析“上火”能量代谢物紊乱和黏膜免疫失调的现象。

在肠道微生物中，厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）是两个占主要地位的门，两者比例在90%以上[6]。厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）比例的上调指示了肥胖患者肠道内的慢性炎症发生[10]。在“上火”人群肠道内，厚壁菌门/拟杆菌门的比例也出现明显上调，这说明“上火”人群的肠道内可能存在炎症。除此之外，食用肉类增加或食用纤维素下降可上调厚壁菌门/拟杆菌门的比例[11]，上述饮食习惯也是“上火”的主要诱因。

在微生物属水平上，某些变化的肠道微生物属与“上火”相关的能量代谢紊乱相关。颤螺菌属（Oscillospira）能帮助宿主细胞降解糖类物质，从而提供能量[12]；瘤胃球菌属（Ruminococcus）通过产生短链脂肪酸类物质为宿主细胞提供能量[13]；考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）在肠道内可通过降解琥珀酸盐为宿主提供能量[14]。因此，这些与宿主能量代谢相关的菌属在“上火”人群中上调，可能是引起能量代谢紊乱的因素之一。另外，某些变化的肠道微生物属也与“上火”相关的免疫失调相关：瘤胃球菌属（Ruminococcus）丰度上调，可导致肠道黏膜层降解，肠道屏障不稳定和轻度黏膜免疫失调[15]；普氏菌属（Prevotella）通过活化TLR2，调控Th17细胞相关的免疫因子，从而引起黏膜免疫失调[16]；栖粪杆菌属（Faecalibacterium）可通过调控核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）途径，抑制炎症反应,帮助宿主机体抵抗炎症[17]。

综上所述，本研究结果证实“上火”发生与肠道菌群改变相关，变化的肠道菌群在一定程度上能反映“上火”导致的能量代谢紊乱和黏膜免疫失衡。