从AMPK能量调节功能探讨红参上火机制

浙江中医药大学 杭州 310053

上火是指因精神紧张、过度劳累、进食辛热药物和食物、气候变化等因素引起的、以头面部口、舌、牙龈、咽喉、鼻、眼等部位皮肤黏膜出现红肿热痛、溃疡为主，并可伴有全身症状的一种轻微且易反复的综合征。临床观察发现，不当进补红参汤或饮用红参酒后会发生上火[1]，而红参引起上火的病理生理机制目前尚无系统的文献报道。课题组前期研究发现，上火的发生伴有能量代谢的紊乱。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）是真核细胞生物中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被称为“细胞能量检测器”，能感知细胞能量代谢状态的改变[2]。研究发现，红参及其有效成分人参皂苷具有活化AMPK的作用，在代谢相关性疾病中发挥作用[3-4]。因此，本实验以AMPK能量调节功能为核心，通过检测红参上火模型大鼠的能量代谢变化，探索红参上火的相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级雌性Wistar大鼠40只，6周龄，体质量（160±20）g。购买于上海西普尔-必凯实验动物有限公司 [实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016]，饲养于浙江中医药大学动物实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠受试前笼养7d适应环境。全封闭清洁级状态下隔离饲养，室温20℃，相对湿度40%～60%，光照12h/d，自由摄食和饮水。

1.2 主要药物和试剂 正官庄牌高丽红参饮片450g（产地：韩国，批号：JY20150235），采购自浙江英特医药药材有限公司，并由该公司出具上海市食品药品检验所提供的检验报告书，检验结果符合进口药材质量标准及2015年中国药典标准。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0012）；抗AMPK抗体、抗增殖物受体γ共激活因子-1α（peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α） 抗体、抗核呼吸因子 1（nuclear respiratory factor 1，NRF1）抗体购于英国Abcam公司（批号：ab32047、ab4481、ab175932）；大鼠血清促甲状腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）、17-羟皮质类固醇（17-hydroxycorticosteroid，17-OHCS）ELISA检测试剂盒购于上海源叶生物科技有限公司（批号：YY02114B、YY02077B）；RNAiso Plus为日本 Takara公司产品（批号：9108）；超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶检测试剂盒、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所（批号：A016-2、A022）。

1.3 仪器 冷冻混合球磨仪购于弗尔德（上海）仪器设备有限公司；凝胶玻璃板、固定架、垂直电泳仪、转印系统、凝胶图像分析系统均为美国Bio-Rad公司产品；台式低温高速离心机、微量移液器购于德国Eppendorf公司；荧光定量PCR仪为瑞士罗氏公司产品；多功能酶标仪购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 红参水煎剂的制备 高丽红参饮片450g，加10倍单蒸水浸泡30min，加热煮沸，文火煎煮1.5h，趁热滤过。按同法再煎煮1次，合并2次滤液，用旋转蒸发器浓缩提取液。

1.4.2 上火动物模型制备 参照常用实验动物及人的体表面积比例乘以系数0.018，将红参临床剂量换算成大鼠的每日用量0.54g，根据大鼠每日灌胃2mL的用量计算出用药浓度。将大鼠随机分为4组，红参高剂量组（药物浓度0.54g·mL-1）、红参中剂量组（药物浓度0.27g·mL-1）、红参低剂量组（药物浓度0.135 g·mL-1）和正常对照组，每组各10只。红参高、中、低剂量组分别以相应剂量红参水煎剂2mL灌胃，1次/d，共15d，建立实热上火大鼠模型；正常对照组以0.9%氯化钠溶液2mL灌胃，1次/d，共15d。灌胃第14天所有大鼠上代谢笼，称量并计算出大鼠上代谢笼前以及下代谢笼后24h的饮食量、饮水量、粪便量及尿量。所有实验大鼠在末次灌胃2h后麻醉，开腹后腹主动脉取血，并完整剥离肝脏。

1.4.3 ELISA法检测TSH、17-OHCS的含量 用蒸馏水按1:20稀释20×洗涤缓冲液。以洗涤缓冲液洗板5次，从室温平衡20 min的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔先加待测血浆样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，以洗涤液重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μL，15min内于450nm波长处测定各孔的OD值。绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.4.4 Western blot检测 AMPK、PGC-1α、NRF1蛋白表达水平 提取肝脏组织蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取20～40μg肝脏组织蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，在冰水浴中转膜2h。转膜后将PVDF膜置于1%BSA的封闭液中，放于水平摇床上，室温封闭1.5h，4℃下一抗孵育过夜。回收一抗溶液，TBST洗膜3次，将膜放于1:10 000稀释的IRDy680或者IRDy880标记的二抗中，避光室温孵育2h。TBST洗膜3次，再将PVDF膜置于Bio-Rad凝胶成像仪中进行扫描，扫描后以Quantity One软件对图像进行光密度值分析。

1.4.5 Real-time PCR 检测 AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表达水平 提取肝脏组织总RNA，用One Drop仪器测定总RNA浓度。将RNA逆转录成cDNA，逆转录条件为37℃ 15min（逆转录反应），85℃5s（逆转录酶失活反应），稳定到4℃。逆转录结束，-20℃保存。cDNA扩增反应条件如下：预变性95℃30s；PCR 反应 95℃ 5s，50℃ 30s，72℃ 45s，共 45 个循环；熔解曲线分析：95℃ 10s，65℃ 60s，97℃ 1s。所有引物都由上海生工生物工程公司合成，具体序列见表1。采用2-△△Ct方法计算mRNA相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 primer sequence

1.4.6 比色法检测Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SDH活力

1.4.6.1 比色法检测Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力 称量大鼠肝脏组织50mg，按质量:体积（g:mL）=1:9的比例，在1.5mL离心管中加入0.9%氯化钠溶液450μL，放入冷冻混合离心仪中充分研磨。研磨充分后，2 500r/min离心10min，取上清液，制成10%上清液匀浆，再用0.9%氯化钠溶液稀释成1%。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。配置基质液，定磷，充分混匀，室温静置5min，在636nm处，1cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度。计算公式如下：

1.4.6.2 比色法检测SDH活动 按照试剂一:试剂二:试剂三:试剂四:试剂五:试剂六=2:0.1:0.1:0.2:0.1:0.1的比例配置工作液，配好后避光保存，并37℃预温5 min以上。在96孔板中加入10μL待测大鼠血浆样本，快速加入260μL工作液。在酶标仪中5s读取一次吸光度（A1值），1分5s再次读取一次吸光度（A2值），求出2次吸光度差值（△A=A1-A2）。计算公式如下：

1.5 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较满足方差齐性时采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t法；多组间比较方差不齐时采用Kruskal-Wallis H检验。计数资料采用率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 造模15d后，红参高、中、低剂量组大鼠均出现不同程度毛发蓬松，烦躁多动的表现，体质量增长缓慢，肛温升高，饮食饮水量增多，大便偏干，小便黄赤、量多。正常对照组活动正常，体质量增长平稳，肛温无明显升高，饮食、饮水量无明显增多。

2.2 各组大鼠体质量比较 造模第1天，各组大鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后第15天，与正常对照组比较，红参各剂量组大鼠体质量增长缓慢，其中红参高、中剂量组大鼠体质量的差异有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组体质量的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。

表2 各组大鼠体质量比较（±s，g）Tab.2 Comparison of weight of each group(±s，g)

表2 各组大鼠体质量比较（±s，g）Tab.2 Comparison of weight of each group(±s，g)

注：与正常对照组相同时点比较，*P＜0.05。Note:Compared with normal control group at the same time,*P＜0.05.

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2.3 各组大鼠肛温比较 造模第1天，各组大鼠肛温差异无统计学意义（P＞0.05）。造模第15天，与正常对照组比较，红参高、中、低剂量组大鼠的肛温均升高，其中高剂量组的肛温差异有统计学意义（P＜0.05）；中、低剂量组的肛温差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠体温比较（±s，℃）Tab.3 Comparison of temperature of each group(±s，℃)

表3 各组大鼠体温比较（±s，℃）Tab.3 Comparison of temperature of each group(±s，℃)

注：与正常对照组相同时点比较，*P＜0.05。Note:Compared with normal control group at the same time,*P＜0.05.

组别 第1天 第15天红参高剂量组红参中剂量组红参低剂量组正常对照组38.13±0.55 38.08±0.52 38.23±0.37 38.16±0.53 38.63±0.42*38.57±0.91 38.45±0.70 38.14±0.77

2.4 各组大鼠进食、饮水、粪便、尿量比较 造模第15天，与正常对照组比较，红参高、中、低剂量组大鼠的进食、饮水量均有增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。红参高、中剂量组粪便量增多，低剂量组粪便量减少。其中中剂量组的粪便量增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；高、低剂量组大鼠的粪便量差异无统计学意义（P＞0.05）。红参高、中、低剂量组大鼠的尿量均增加。其中中剂量组的尿量增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；高、低剂量组大鼠的尿量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠进食、饮水、粪便、尿量比较（±s）Tab.4 Comparison of diet,drinking,feces and urine of each group(±s)

表4 各组大鼠进食、饮水、粪便、尿量比较（±s）Tab.4 Comparison of diet,drinking,feces and urine of each group(±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05。Note:Compared with normal control group,*P＜0.05.

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2.5 各组大鼠TSH、17-OHCS表达比较 造模第15天，与正常对照组比较，红参高、中、低剂量组大鼠TSH以及17-OHCS含量均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.001）。见表 5。

表5 各组大鼠TSH、17-OHCS表达比较（±s）Tab.5 Comparison of TSH,17-OHCS of each group(±s)

表5 各组大鼠TSH、17-OHCS表达比较（±s）Tab.5 Comparison of TSH,17-OHCS of each group(±s)

注：与正常对照组比较，***P＜0.001。Note:Compared with normal control group,***P＜0.001.

组别 TSH（mU·L-1） 17-OHCS（μmol·L-1）红参高剂量组红参中剂量组红参低剂量组正常对照组12.92±0.94***11.03±0.91***9.39±0.93***7.16±1.12 40.33±1.11***34.18±2.86***29.26±2.79***22.27±3.54

2.6 各组大鼠AMPK及下游PGC-1α、NRF1的表达比较

2.6.1 各组大鼠AMPK、PGC-1α、NRF1蛋白表达比较 造模第15天，与正常对照组比较，红参高、中、低剂量组AMPK、NRF1的蛋白表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。低剂量组PGC-1α蛋白表达上调，但差异无统计学意义（P＞0.05）。红参高、中剂量组PGC-1α蛋白表达均上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 1。

2.6.2 各组大鼠AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表达比较 与正常对照组比较，红参高、低剂量组的AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA 表达量均上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组的 AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表达量亦上调，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。

图1 各组大鼠的AMPK、PGC-1α、NRF1蛋白比较Fig.1 Comparison of protein expression of AMPK,PGC-1α,NRF1 of each group

2.7 各组大鼠SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力比较 造模第15天，与正常对照组比较，红参各剂量组大鼠SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均升高。其中红参高、中剂量组SDH活力高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。红参高、中剂量组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001），低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。

图2 各组大鼠AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表达比较Fig.2 Comparison of mRNA of AMPK,PGC-1α,NRF1 of each group

表6 各组大鼠SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力比较（±s）Tab.6 Comparison of activity of SDH,Na+-K+-ATP enzyme,Ca2+-Mg2+-ATP enzyme of each group(±s)

表6 各组大鼠SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力比较（±s）Tab.6 Comparison of activity of SDH,Na+-K+-ATP enzyme,Ca2+-Mg2+-ATP enzyme of each group(±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note:Compared with normal control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.64±0.18***2.44±0.30***2.01±0.25 1.83±0.14组别 SDH（U·mL-1） Na+-K+-ATP 酶（U·mgprot-1） Ca2+-Mg2+-ATP 酶（U·mgprot-1）红参高剂量组红参中剂量组红参低剂量组正常对照组49.30±3.77*51.54±2.96*48.53±3.41 44.57±3.70 3.04±0.27***2.69±0.29**2.51±0.28 2.23±0.12

3 讨论

红参是五加科植物人参的栽培品经蒸制后的干燥根及根茎，其味甘，微苦，性温，香味浓厚。归脾、肺、心、肾经，具有大补元气、复脉固脱、益气摄血的功效[5]。高丽红参是指朝鲜半岛出产的人参，完全成熟的高丽红参通常选用生长了6年的人参炮制而成，是稀有的珍品。因此，高丽红参是老百姓热衷的补品之一。《素问·阴阳应象大论》曰：“气厚者为阳，薄为阳之阴……气薄则发泄，厚则发热。”红参性温，当属气厚者，气厚者有助阳发热的作用。过服或久服会影响阴阳偏颇，造成人体阳气的病理性亢盛，出现一派实热上火的症状。因此，红参的温性与上火的发生密切相关。现代研究运用微量量热法测定红参的生物热效应，证实其性偏热。温热药作用于机体一般表现为功能的亢奋，机体功能亢奋则需要消耗较多的能量,就会产生较多的热量[6]，故推断其引起的热量蓄积可能是造成上火的机制之一。

目前尚无关于上火动物模型的文献报道。从中医八纲辨证而言，实热上火属于实热证的范畴。因此，本实验借鉴了实热证的造模方法，用高丽红参煎液灌胃大鼠15d，建立实热上火的动物模型。大鼠出现体重增长缓慢，肛温升高明显，进食、饮水量均增加，大便偏干，小便黄赤、量多等表现，与中医上火的临床表现相近。

血中TSH是由腺垂体分泌的一种糖蛋白，是直接调节甲状腺功能的关键激素[7]385,396。TSH是反映下丘脑-垂体-甲状腺轴功能的敏感指标，甲状腺功能改变时，TSH的波动较T3、T4更迅速而显著[8]45。因此，TSH可反映下丘脑-垂体-甲状腺轴的功能。17-OHCS主要是指肾上腺皮质分泌的皮质醇、皮质素和它们的代谢产物，由肾脏排出，所以测定血中17-OHCS可以反映交感神经-肾上腺皮质功能[7]408。当肾上腺皮质功能亢进时，外周17-OHCS的排出量增加。文献报道，温热药有提高交感神经-肾上腺系统活性的作用，包括下丘脑-垂体-肾上腺皮质、下丘脑-垂体-甲状腺等[8]43。本实验用ELISA法检测红参上火大鼠模型的血清TSH、17-OHCS后发现，各组别TSH、17-OHCS含量相比正常对照组均明显升高。该结果体现了红参的温热性质，也说明了红参上火模型存在交感神经-肾上腺功能的增强。结合大鼠精神烦躁多动、体重增长缓慢、肛温升高、饮食饮水量增多、大便偏干、小便黄赤等体征，提示实热上火动物模型的建立。此外，大鼠肛温、体质量、饮食、饮水量等实热上火表现以及TSH、17-OHCS的表达量升高与红参给药量呈正相关关系，说明了过量进补红参，会引起上火。

课题组前期研究发现，上火存在能量代谢的紊乱。AMPK能感知细胞能量代谢状态的改变，活化的AMPK可以增强分解代谢，抑制合成代谢，参与细胞糖、脂肪、蛋白质代谢等能量代谢过程，增加细胞能量储备，应对能量缺乏。活化的AMPK可以通过调节过下游PGC-1α和NRF1提高线粒体能量代谢[9-11]。PGC-1α是一个转录共激活因子，具有线粒体生物合成、肌纤维类型的转化、葡萄糖代谢、脂肪酸氧化等功能[12]。它与能量代谢关系密切，且具有组织表达的特异性，主要在能量需求较高、线粒体丰富的组织中表达[13-14]。活化的AMPK通过直接作用于下游PGC-1α的Ser538和Thr177残基，促进其转录，进而促进线粒体基因表达和线粒体生成[15]。PGC-1α能激活NRFs形成复合物，有效增强线粒体DNA的复制与转录过程，调节线粒体生物合成。研究发现，红参及人参皂苷均有活化AMPK的作用，在代谢相关性疾病的调控中发挥重要的作用[3-4，16]。本实验发现，与正常对照组比较，高、中剂量组大鼠 AMPK、PGC-1α、NRF1 的蛋白表达均上调。高、低剂量组大鼠AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表达均上调。因此，笔者认为红参上火模型大鼠存在AMPK功能活化，活化的AMPK作用于下游PGC-1α及NRF1等因子，促进线粒体生物合成和ATP的产生，增强机体的能量代谢。提示了红参引起的上火存在能量代谢的增强，其机制可能与红参活化AMPK有关。

SDH是葡萄糖糖代谢三羧酸循环途径中一种重要的酶，也是线粒体内膜氧化呼吸链复合体的组成酶之一[17]，具有催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸的作用[18-19]。它的活力反映了三羧酸循环、组织氧化代谢水平及机体的能量生成情况[20]。研究发现，AMPK能调节SDH的活力[21-22]。实验发现，实热上火模型SDH活力升高，说明了三羧酸循环的加快以及线粒体中ATP合成增加，提示了能量代谢处于旺盛的状态，其机制可能与AMPK活化后上调SDH活力有关。

Na+-K+-ATP酶又称为钠-钾泵，简称钠泵。它对维持细胞的正常生理功能起着极其重要的作用，可将细胞内的ATP水解为二磷酸腺苷（adenosine diphos－phate，ADP），并利用高能磷酸键贮存的能量完成Na+、K+的跨膜转运[7]15。与ATP的分解和利用有关，故Na+-K+-ATP酶活力是反映机体能量代谢水平和生理功能状态的重要指标[23]。Ca2+-Mg2+-ATP酶又称为钙泵，机制与钠泵相似[7]16。二者是衡量线粒体功能和能量代谢水平的重要指标[23]。研究发现，AMPK对钠泵、钙泵具有促进作用[24-25]。因此，本实验进一步检测了Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量的变化来反映能量代谢的变化。本研究发现，红参高、中剂量组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量均高于正常对照组，且差异具有统计学意义。说明了线粒体中ATP分解代谢增强，提示了机体能量代谢处于旺盛的状态，其机制可能与AMPK上调了钠泵、钙泵活力有关。

综上所述，红参引起的实热上火大鼠模型存在能量代谢增强，其机制与红参引起AMPK活化，进一步导致其下游能量代谢相关因子PGC-1α、NRF1表达上调，能量代谢相关的琥珀酸脱氢酶、钠泵、钙泵活力升高有关。该结果提示了上火与能量代谢增强的相关性，但其与葡萄糖代谢、脂肪酸代谢等能量代谢过程的具体关联还有待进一步研究。