不同黄酮类物质对蚕豆根瘤菌生长的影响*

王静静 董 艳 肖靖秀 汤 利 郑 毅,2

(1. 云南农业大学资源与环境学院，云南 昆明 650201；2. 云南省教育厅，云南 昆明 650223)

现代农业生产模式中氮肥对提高农作物产量效果十分显著，我国已经成为世界最大的化肥生产国和消费国[1]，其中过量施用氮肥，既严重浪费资源也影响农产品品质、污染土壤、水体、大气生态环境并降低生物多样性[2]。豆科作物能够与根瘤菌形成根瘤,将大气中的氮固定为有机氮，从而减少化学氮肥，有利于减轻水土污染，提高土壤生物多样性等[3-4]。因此，在高生产力条件下充分挖掘豆科植物生物固氮的潜力，对可持续的粮食生产体系具有重要作用。

黄酮类物质是一类广泛存在于植物体内的次生代谢产物，在调节植物与环境之间的相互作用方面具有重要作用[5]。根系分泌物中的黄酮类物质作为结瘤的初始信号，主要是通过根系分泌物向土壤环境释放并被根瘤菌感知，在豆科作物结瘤过程中具有关键作用[6-8]。Novak等[9]人将柚皮素、橙皮素和槲皮素分别加入到豌豆 (Pisumsativum) 的培养体系中，发现高浓度 (10～100 μg/mL) 促进了豌豆根毛的卷曲变形，即早期的结瘤响应。Li等[10]研究亦发现，外源添加槲皮素黄酮和毛地黄黄酮均对蚕豆结瘤具有显著促进效应，分别比对照增加蚕豆根瘤干重95%和160%。目前，国内外对大豆 (Glycinemax)、苜蓿 (MedicagoSativa)、豌豆和木豆 (Cajanuscajan) 等豆科植物根系分泌结瘤信号物质已经开展了大量研究，在这些豆科作物根系分泌物中均发现了柑桔素、圣草酚、芹菜素、毛地黄黄酮、槲皮黄酮等黄酮类物质[11]，而有关蚕豆根系分泌物中黄酮类分泌物的种类研究不多。蚕豆 (Viciafaba) 是世界上重要的豆科作物之一，具有较强的根际酸化能力，可以利用固氮根瘤菌形成根瘤并固定土壤中的氮[12-14]。因其具有粮食、蔬菜、饲料和绿肥兼用等特点，适应性广，具有较高的固氮量，在世界范围内广泛种植。为此，本实验以蚕豆根瘤菌为研究对象，探讨不同黄酮类物质对蚕豆根瘤菌生长的影响，并分析不同浓度的黄酮类物质对根瘤菌数量、吸光度及菌落生长的影响，旨在为豆科作物的结瘤固氮，节肥增产提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试蚕豆根瘤菌菌种为Mesorhizobiumhuakuii93 (Mh 93)，由中国农业科学院微生物研究所提供。黄酮类物质 (柚皮素、橙皮素、槲皮素、染料木素) 均为标准品，由德国西格玛公司提供。

1.2 实验地点

实验于2017年9—10月在西南林业大学国家高原湿地研究中心进行，西南林业大学位于云南省中东部，气候属亚热带高原季风气候，多年平均气温为16.5 ℃，全年日照2 088.6 h，年均降雨量1 045.1 mm，年均蒸发量2 099.7 mm。

1.3 实验设计

选取4种黄酮物质 (即橙皮素、柚皮素、槲皮素、染料木素)，每种黄酮物质设5个浓度 (0、0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL)，共60个处理，每个处理3个重复，以无菌水为对照。

1.4 样品采集

蚕豆根瘤菌菌种活化过程：首先将蚕豆根瘤菌菌株在固体YMA培养基上划线进行接种，然后在温度条件为28 ℃的培养箱里培养3 d至菌苔丰满后，再在培养丰满的菌苔里用接种环挑选菌落于YMA的液体培养基中，并用摇床 (转速为150 r/min，温度为28 ℃)充分振荡3 d，得到菌悬液[15]。

黄酮物质培养实验[16]：在50 mL的离心管中加入10 mL YMA培养基 (1 L配方为：酵母粉1.0 g，甘露醇10.0 g，氯化钠0.1 g，七水硫酸镁0.2 g，磷酸氢二钾0.5 g，碳酸钙1.0 g，琼脂18～20 g，pH 6.6～7.0)；接着分别加入5 mL黄酮类物质 (柚皮素、橙皮素、槲皮素、染料木素)；然后再加入25 μL蚕豆根瘤菌菌株的悬浊液培养，而对照管中则分别加入5 mL无菌盐水和25 μL根瘤菌菌株悬浊液，每个处理4个重复；最后将离心管在旋转摇床 (转速150 r/min，温度为28 ℃)振荡48 h，得到待测菌悬液，用于根瘤菌数量、根瘤菌吸光度以及根瘤菌菌落直径的测定。

1.5 测定方法

根瘤菌数量测定：采用菌落平板计数法；根瘤菌吸光度测定：采用紫外分光光度计测定 (MY13490022)；根瘤菌直径测定：采用德国麦思德不锈钢一体式游标卡尺 (MASTERPROOF428) 测定。

1.6 数据与分析

采用Excel 2007软件对数据进行预处理与作图，采用SPSS 20.0统计分析软件对数据进行差异显著分析 (LSD法，P< 0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同黄酮种类及浓度对蚕豆根瘤菌生长的影响

2.1.1柚皮素对蚕豆根瘤菌生长的影响

由图1可知，柚皮素对蚕豆根瘤菌生长的具有显著的促进作用。与对照 (CK) 相比，在添加浓度为0.4，0.8，1.2，1.6 μg/mL时，蚕豆根瘤菌的数量分别显著提高了52.38%、228.57%、300%和142.86%。此外，随着柚皮素浓度的增加，蚕豆根瘤菌数量呈先增加后降低的生长趋势，且在1.2 μg/mL时数量达到最多。上述结果说明，柚皮素在一定的浓度范围内可以促进蚕豆根瘤菌的生长，但过高浓度的柚皮素则对蚕豆根瘤菌的生长具有抑制作用。

不同小写字母表示不同浓度间差异显著 (P< 0.05)。

图1不同浓度的柚皮素对蚕豆根瘤菌数量的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of naringenin on the quantity of faba bean rhizobia

2.1.2橙皮素对蚕豆根瘤菌生长的影响

橙皮素对蚕豆根瘤菌生长的影响见图2，随着橙皮素浓度的增加，蚕豆根瘤菌数量表现出逐渐增加的生长趋势。与对照 (CK) 相比，橙皮素浓度在0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL时，蚕豆根瘤菌数量分别显著增加了2.29、3.14、3.62、4.38倍，说明橙皮素对蚕豆根瘤菌的生长具有明显的促进作用。

不同小写字母表示不同浓度间差异显著 (P< 0.05)。

图2不同浓度的橙皮素对蚕豆根瘤菌数量的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of hesperetin on the quantity of faba bean rhizobia

2.1.3槲皮素对蚕豆根瘤菌生长的影响

由图3可知，槲皮素对蚕豆根瘤菌的生长亦有明显的促进效应。随着槲皮素浓度的增加，蚕豆根瘤菌数量呈现先增后减的生长趋势，在浓度1.2 μg/mL时根瘤菌数量达到顶峰。与对照(CK)相比，在槲皮素浓度为0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL时，蚕豆根瘤菌数量分别增加了114.29%、147.62%、342.86%和266.67%，且达到显著性差异水平。说明槲皮素在合理的浓度范围内可以促进蚕豆根瘤菌的生长，但浓度过高则会抑制蚕豆根瘤菌的生长。

不同小写字母表示不同浓度间差异显著 (P< 0.05)。

图3不同浓度的槲皮素对蚕豆根瘤菌数量的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of quercetin on the quantity of faba bean rhizobia

2.1.4染料木素对蚕豆根瘤菌生长的影响

染料木素对根瘤菌生长亦有显著的促进作用见图4。

不同小写字母表示不同浓度间差异显著 (P< 0.05)。

图4不同浓度染料木素对蚕豆根瘤菌数量的影响
Fig.4 Effects of different concentrations of genistein on the quantity of faba bean rhizobia

与对照 (CK) 相比，随着染料木素浓度的增加 (0.4～1.6 μg/mL)，根瘤菌数量分别显著增加了2.38、3.38、4.62和6.48倍。此外，随着染料木素浓度的增加，蚕豆根瘤菌数量呈现出递增的生长趋势，且在1.6 μg/mL浓度时根瘤菌数量达到最大值 (136 × 106个)。上述结果说明，染料木素可以明显有效地促进蚕豆根瘤菌的生长。

2.1.5不同黄酮类物质对蚕豆根瘤菌生长的影响

黄酮类物质对蚕豆根瘤菌数量的影响效应见图5。促进效应表现为：染料木素 > 橙皮素 > 槲皮素 > 柚皮素。在低浓度0.4 μg/mL时，橙皮素、槲皮素及染料木素的蚕豆根瘤菌数量较柚皮素分别显著增加了50.00%、40.63%和56.25%，而在0.8 μg/mL时没有显著差异。在浓度1.2 μg/mL时，槲皮素、染料木素的蚕豆根瘤菌数量亦高于柚皮素与橙皮素；而在高浓度1.6 μg/mL时染料木素的蚕豆根瘤菌数量显著高于其他3个黄酮类物质。上述结果说明，黄酮类物质可影响蚕豆根瘤菌的生长。

不同小写字母表示不同黄酮类物质在同一浓度下差异显著 (P< 0.05)。

图5不同黄酮类物质对蚕豆根瘤菌数量的影响
Fig.5 Effects of different flavonoids on the quantity of faba bean rhizobia

2.1.6不同黄酮种类及浓度对蚕豆根瘤菌吸光度 (OD) 的影响

不同黄酮种类及浓度对蚕豆根瘤菌吸光度的作用效应见表1。不同的黄酮类物质 (柚皮素、橙皮素、槲皮素和染料木素) 对蚕豆根瘤菌吸光度都有显著的影响，而黄酮类物质在不同浓度下对蚕豆根瘤菌吸光度亦有显著的促进效应。与对照 (CK) 相比，添加浓度在0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL时，柚皮素的蚕豆根瘤菌吸光度 (OD) 分别显著提高了1.23、1.92、5.38和3.46倍，橙皮素的蚕豆根瘤菌吸光度 (OD) 分别显著提高了2.85、8.54、12.92和13.69倍，槲皮素的蚕豆根瘤菌吸光度 (OD) 分别显著提高了5.69、6.00、7.15和5.92倍，染料木素的蚕豆根瘤菌吸光度 (OD) 分别显著提高了1.54、2.08、2.77和4.38倍，且柚皮素和槲皮素在浓度为1.2 μg/mL时吸光度最大，而橙皮素和染料木素在浓度为1.6 μg/mL时吸光度最大，以橙皮素的促进作用最为显著。上述说明，黄酮类物质可以有效地促进蚕豆根瘤菌的生长，但不同黄酮种类的有效浓度范围是不同的。

表1 不同黄酮种类及浓度对蚕豆根瘤菌吸光度 (OD) 的影响Table 1 The effects of different flavonoids and their concentrations on the absorbance of rhizobia

注：不同小写字母表示不同浓度间差异显著 (P< 0.05)。

2.2 不同黄酮种类及浓度对蚕豆菌落生长的影响

由表2可知，黄酮类物质 (柚皮素、橙皮素、槲皮素、染料木素) 对蚕豆根瘤菌菌落大小均有显著的促进效应。与对照 (CK) 相比，添加浓度在0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL时，柚皮素的蚕豆根瘤菌菌落直径分别显著增加了1.56、2.34、4.05和1.21倍，橙皮素的蚕豆根瘤菌菌落直径分别显著增加了1.78、3.26、4.66和1.81倍，槲皮素的蚕豆根瘤菌菌落直径分别显著增加了1.44、3.44、5.59和2.68倍，染料木素的蚕豆根瘤菌菌落直径分别显著增加了1.63、2.10、3.01和5.33倍，并且皆在1.2 μg/mL时菌落直径最大，分别为2.9、3.4 mm和4.0 mm (除染料木素在1.6 μg/mL时菌落直径最大外)，以槲皮素的促进效应最明显。上述结果说明，适宜浓度的黄酮类物质可以有效地促进蚕豆根瘤菌的生长，但不同的黄酮种类具有不同的有效浓度范围。

表2 不同黄酮种类及浓度对蚕豆根瘤菌菌落直径大小的影响Table 2 The effects of different flavonoids and their concentrations on the colony diameter of rhizobia mm

注：不同小写字母表示不同浓度间差异显著 (P< 0.05)。

3 结论与讨论

根瘤菌是一类生活在土壤中的革兰氏阴性杆状细菌，在合适的条件下，根瘤菌能侵染豆科植物并与之进行共生结瘤固氮。根瘤菌与豆科植物的共生是生物固氮体系中作用最强的体系，据估计所固定的氮约占生物固氮总量的65%，在农业生产中起着极其重要的作用；根系分泌物在根际相互作用中起着 “语言” 的作用，而根系分泌物中黄酮类物质作为诱导特异根瘤菌对寄主植物根系进行识别和定殖的重要信号分子，在结瘤过程中起关键作用[17]。Paul等[18]和Lian等[19]的研究表明，小麦根系分泌物可以诱导大豆结瘤因子的合成。李白[20]的研究亦发现，玉米//蚕豆系统中外源添加玉米根系分泌物显著促进了蚕豆的结瘤作用。本实验发现，黄酮类物质 (柚皮素、橙皮素、槲皮素与染料木素) 均显著影响蚕豆根瘤菌的数量、吸光度以及菌落直径大小，其中染料木素对根瘤菌数量、橙皮素对根瘤菌吸光度以及槲皮素对根瘤菌菌落直径的效应最大。此外。黄酮类物质的浓度也显著影响蚕豆根瘤菌的生长，随着浓度的增加，添加柚皮素、槲皮素的蚕豆根瘤菌数量、吸光度及菌落直径大小均呈现先增加后降低的趋势，并在浓度为1.2 μg/mL时根瘤菌生长效应最显著；而橙皮素和染料木素的效应则呈递增趋势，除蚕豆根瘤菌菌落直径大小随橙皮素浓度增加呈先增加后降低的趋势外。这些发现说明，不同的黄酮种类及其在不同浓度范围对蚕豆根瘤菌生长的效应不同，并且在合理的浓度下可以有效促进蚕豆根瘤菌的生长。

豆科作物通过根瘤菌和豆科作物根际的信号识别启动固氮过程，而黄酮类物质分泌作为结瘤作用的初始信号，通过作用于土壤中自由存在的根瘤菌而诱导根瘤菌结瘤基因的表达，激活根瘤菌蛋白Nod D，在Nod D的协同下，诱导根瘤菌结瘤基因的表达，合成专一性极高的脂-二壳糖寡糖 (LCOs)，即结瘤因子[20-27]。然而，这是一个非常复杂的根际过程，因此本实验中探讨的几个黄酮类物质是否都作为信号物质参与了蚕豆结瘤根际过程，哪种黄酮类物质在结瘤过程发挥最关键的作用，还需要探索与证实。

本研究中，柚皮素、橙皮素、槲皮素与染料木素对蚕豆根瘤菌的数量、吸光度以及菌落直径大小均有明显的影响，且每种黄酮物质的促进效应各不同。此外。黄酮类物质的浓度也显著影响蚕豆根瘤菌的生长，蚕豆根瘤菌的数量、吸光度及菌落直径大小均随柚皮素、槲皮素浓度增加而呈先增加后降低，且均在浓度为1.2 μg/mL 时数值达到最大；根瘤菌的数量、吸光度及菌落直径大小则随着橙皮素和染料木素浓度增加而增加，其中染料木素在浓度为1.6 μg/mL时菌落直径达到最大，最大值为值3.89 mm。