超高效液相色谱—串联质谱法测定猪肉中 5种β—受体激动剂残留

代立勤 崔银仓

摘要 建立了猪肉样中5种β-受体激动剂克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林和西马特罗的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。样品量取后，加入乙酸钠水溶液，采用β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解处理（37 ℃），过滤后，用MCX固相萃取柱净化，采用UPLC-MS/MS 多反应监测（MRM）模式检测，内标法定量。5种β-受体激动剂的检出限均为0.125 μg/kg，定量下限为0.25 μg/kg，在0.25、0.5、1.0 μg/kg 3个浓度添加水平，总体平均回收率为83.3%～115.0%，总体相对标准偏差均在10%以内。本方法分析速度快，灵敏度高，重现性好，各项技术指标均满足国内外相关法规要求，可用于各种动物源性样品中5种β-受体激动剂残留的快速检测。

关键词 受体激动剂；猪肉；超高效液相色谱-串联质谱法

中图分类号 TS251.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）13-0253-02

受体激动剂亦称完全激动剂（full agonist），对受体有较强亲和力和内在活性，能通过受体兴奋发挥最大效应。β-受体激动剂，俗称瘦肉精，是一类化学合成的结构和功能类似于肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，包括非选择性β-受体激动剂如异丙肾上腺素，选择性心脏β1-受体激动剂如多巴酚丁胺，选择性β2-受体激动剂如沙丁胺醇、叔丁、喘宁等。β2-受体激动剂可兴奋气道平滑肌和肥大细胞膜表面的β2-受体，其通过舒张气道平滑肌、减少肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒及其介质的释放、降低微血管的通透性、增加气道上皮纤毛的摆动等途径缓解哮喘症状。我国农业部1997年发文禁止瘦猪肉精在饲料和畜牧生产中使用，商务部自2009年12月9日起禁止进出口莱克多巴胺和盐酸莱克多巴胺 。2001年12月27日及2002年2月9日、4月9日，农业部分别下文禁止使用β-激动剂类药物作为饲料添加剂（农业部176号公告、193号公告、1519号条例）。β-受体激动剂具有苯乙醇胺结构母核，为苯乙醇胺类物质。按照苯环上取代基的不同，可分为苯胺型和苯酚型，而苯酚型β-受体激动剂又分为邻苯二酚型、间苯二酚型及水杨醇型。目前，检测β-受体激动剂的方法主要有高效液相色谱法[1]、气相色谱质谱联用法[2-4]、液相色谱质谱联用法[5-10]及酶联免疫法[11-12]等。本文主要对猪肉样中的克伦特罗（Cl-enbuterol）、莱克多巴胺（Ractopamine）、沙丁胺醇（Salbut-amol）、西马特罗（Cimaterol）和特布他林（Tulobuterol）进行了针对性的研究。β-受体激动剂的母核结构及此次研究的几种化合物有以下种类。①苯酚型：沙丁胺醇，取代基位置为R1（CH2OH）、R2（OH）、R3（H）、R4（H）、R5（CH3）、R6（CH3）；莱克多巴胺，取代基位置为R1（H）、R2（OH）、R3（H）、R4（H）、R5（H）、R6（CH2-CH2-P-OH）；特布他林，取代基位置为R1（OH）、R2（H）、R3（OH）、R4（H）、R5（CH3）、R6（CH3）。②苯胺型：克伦特罗，取代基位置为R1（Cl）、R2（NH2）、R3（Cl）、R4（H）、R5（CH3）、R6（CH3）；西马特罗，取代基位置为R1（H）、R2（NH2）、R3（N）、R4（H）、R5（CH3）、R6（H）。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC H-Class（美国Waters公司）；Xevo TQD质谱仪（美国Waters公司）；高速匀浆机（德国IKA）。

甲醇、乙腈、甲酸均为进口色谱纯；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（德国Merck公司）；试验用水为屈臣氏蒸馏水。

标准品：特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺和克伦特罗，纯度均≥98.0%；克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、特布他林-D9、西马特罗-D7，纯度均 ≥92.0%。

SPE小柱：MCX固相萃取柱（6 mL，500 mg），購自上海安谱公司。

1.2 标准溶液配制

标准（外标）储备液（100 μg/mL）：准确称取适量的特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗对照品，用甲醇分别配制成100 μg/mL标准储备液，置于0～5 ℃冰箱中保存，有效期为3个月。标准（内标）储备液：克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、特布他林-D9、西马特罗-D7对照品，用甲醇分别配制成10 μg/mL的标准储备液，0～5 ℃冰箱中保存，有效期为3个月。中间使用液：使用时用甲醇配制成100 ng/mL的混标溶液。基质标准曲线：选取空白猪肉样，与样品前处理步骤同步进行处理，最后用1.0 mL 0.1%甲酸溶液溶解，制成浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的混合标准工作液，其中内标浓度均为20 ng/mL。

1.3 样品处理与净化

1.3.1 酶解。准确量取2.0 g试样，置于50 mL具螺旋盖的聚丙烯离心管中，添加20 μL同位素内标工作液，加入10 mL乙酸钠缓冲溶液（pH =5.2），然后加入50 μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，充分振荡混匀，37 ℃避光恒温震荡酶解16 h。

1.3.2 提取。酶解后放置至室温，并涡旋混匀，在5 ℃条件下10 000 r/min高速离心5 min，收集上清液于50 mL离心管内，加入5 mL正己烷，涡旋混匀。5 ℃条件下10 000 r/min离心10 min，弃去正己烷层。再向离心管中加入5 mL正己烷，涡旋混匀，5 ℃条件下10 000 r/min离心10 min，弃去正己烷层，将离心管中的水相溶液立即经滤纸或者脱脂棉过滤，并用 5 mL乙酸钠缓冲溶液洗涤滤纸，用10 mol/L NaOH溶液调pH值至9.5±0.2，待净化。

1.3.3 净化。将所得滤液全部加载在固相萃取柱（MCX）上，再依次用6 mL 0.1 mol/L盐酸溶液、6 mL水、6 mL 50%甲醇淋洗小柱，弃去淋洗液；負压下抽干2 min，用5 mL洗脱液（甲醇∶氨水=95∶5）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50 ℃下氮吹吹干，加入1 mL 0.1%甲酸溶液溶解残渣，样液过0.2 μm滤膜后直接上机。

1.3.4 结果计算。内标法定量。

1.4 LC-MS/MS 条件

1.4.1 色谱条件。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC？誖 BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），Part No：186002350；流动相及梯度洗脱条件：流动相为0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液，以总体积为100%计算，流动相速度为0.25 mL/min；0～6.5 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由20%变化至90%，6.5～7.5 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由90%变化至25%，7.5～9.0 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由25%变化至67%，0～10 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由67%变化至20%，10～12 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例不变。

1.4.2 质谱条件。电喷雾电压：3.00 kV，离子源温度：110 ℃；色谱柱温度：30 ℃；洗脱溶剂温度：350 ℃；气体流量（N2）：650 L/h；锥孔气流量（N2）：50 L/h；流动相流速：0.250 mL/min。

2 结果与分析

2.1 样品基质效应的消除

动物性肉样成分组成复杂，含有大量的脂肪和蛋白质等，如果前处理过程的提取、净化中残留过多的样品基质，将会影响到分析检测的灵敏度和准确性。因为样品基质对离子电离有抑制作用，不同的基质往往造成的基质效应也不同。为消除样品基质效应，在空白样品中添加本次试验研究的5种β-受体激动剂和对应的内标进行前处理，可使标样和样品溶液具有同样的离子化条件，从而消除样品的基质效应，提高分析结果的准确度。

通过使用标准物质进行调谐，不断优化仪器条件，使每种物质的响应值达到要求的最低范围，最终保证定性、定量、准确。表1为最终得到的质谱条件各项数值。

2.2 标准曲线和加标回收率

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、西马特罗标准品质量浓度在0.5～50.0 ng/mL范围内，采用同位素内标法，分别以定量离子峰面积比值（定量离子峰面积与内标峰面积之比）为纵坐标，以质量浓度比值（化合物质量浓度与内标质量浓度之比）为横坐标，绘制标准曲线。选取空白样品进行加标回收率测定，选取0.25、0.5、1.0 μg/kg 3个浓度添加水平为最终测定浓度进行空白样品添加，5种受体激动剂的回收率范围为83.3%～115.0%（表2）。

2.3 方法检出限定量限

方法检出限按S/N=3 计算，5 种β-受体激动剂检出限都可以达到0.125 μg/kg；定量限按照S/N=10 计算，5种β-受体激动剂检测限都可以达到0.25 μg/kg，方法检出限和定量限均满足目前5种β-受体激动剂最大限量值检测要求。

3 结论

本文建立了猪肉样中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林和西马特罗5种药物同时分析的LC-MS/MS 分析方法。该方法具有简单、准确和灵敏的特点，能够满足药物残留分析要求，此方法也可被推广应用到其他动物性产品的受体激动剂检测中。

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