大豆异黄酮对慢性脑缺血大鼠海马胆碱能神经元的保护作用

杨振军，张祥云，陈志宏，薛景凤△

（1.承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000；2.河北省军区承德离职干部休养所）

血管性痴呆（vascular demential，VD）是由于脑血管病变，引起认知、学习、记忆功能障碍的一种获得性智能损害综合征[1]。研究表明，雌激素可以改善脑血管功能[2]。大豆异黄酮是一类植物雌激素，具有雌激素样活性，且能避免雌激素替代治疗过程中的严重不良反应[3]。但关于大豆异黄酮是否能在慢性脑缺血时发挥保护脑神经元的作用，报道较少。本研究观察了大豆异黄酮对慢性脑缺血大鼠海马胆碱能神经元的保护作用，以期为临床应用大豆异黄酮预防及治疗慢性脑缺血导致的海马神经元损伤及认知障碍提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物的选择、分组、处理健康成年雌性SD大鼠30只，体质量250～300g（购于河北医科大学实验动物中心，合格证号：712024）。大鼠随机分组：假手术组（n=10）、模型组（n=10）、治疗组（n=10）。模型组和治疗组大鼠，采用切除双侧卵巢并永久性结扎双侧颈总动脉的方法建立慢性脑缺血模型[4]；建立模型后，治疗组大鼠给予大豆异黄酮(84%纯度，华北制药股份有限公司，批号：060104，剂量9mg/kg/d)灌胃21d，模型组大鼠给予等容积生理盐水灌胃21d。假手术组切开腹部皮肤，分离双侧卵巢，不切除卵巢；同时切开颈部皮肤，分离双侧颈总动脉，不做结扎，常规饲养21d。

1.2 免疫组织化学染色及定量分析三组大鼠均于术后第21天处死取材。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌流固定，4h后取脑，截取大脑横裂至视交叉平面的脑组织，4%多聚甲醛后固定过夜，常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚6 μm。切片时，自海马水平部出现开始，每隔10张取蜡带贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，用于免疫组织化学染色。采用SP免疫组织化学染色法观察海马神经元胆碱乙酰基转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）蛋白的表达情况：一抗为兔抗，稀释浓度为1：200；用PBS代替一抗作为阴性对照，以细胞内出现棕黄色细腻颗粒弥漫分布为ChAT阳性反应；DAB显色，苏木精复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；Olympus光学显微镜下观察并摄片。

ChAT定量分析：采用MiVnt图像分析系统对免疫组织化学阳性结果进行定量分析。于海马CA1区任取3个视野（10×20倍），计算阳性产物面积占视野面积的百分比，作为ChAT蛋白的相对表达水平。每例标本选取5张切片，每张切片选取3个视野，取平均值。

1.3 统计分析数据以（±s）表示，组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；采用SPSS 19.0统计软件进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

ChAT免疫组织化学染色及定量分析结果：ChAT免疫反应阳性产物呈棕黄色颗粒状，位于细胞核，偶见胞质着色；海马水平部各区均可见ChAT蛋白的表达，以CA1区居多。假手术组大鼠海马CA1区ChAT蛋白的表达显著多于模型组和治疗组（P＜0.05）；治疗组大鼠海马CA1区ChAT蛋白的表达较模型组明显增多（P＜0.05）。见附图、附表：

附表 各组大鼠海马CA1区神经元ChAT蛋白的表达（±s）

附表 各组大鼠海马CA1区神经元ChAT蛋白的表达（±s）

与模型组、治疗组比较：aP＜0.05；与治疗组比较：bP＜0.05；

组别 n ChAT假手术组 10 0.145±0.018a模型组 10 0.068±0.005b治疗组 10 0.130±0.018

附图 各组大鼠海马CA1区神经元ChAT蛋白的表达（10×20）

3 讨论

慢性脑缺血是导致血管性痴呆（VD）的主要原因，VD发病早期的核心症状是记忆力衰退。海马与学习记忆密切相关，是大脑近期记忆环路的主要结构，对缺血、缺氧损伤极为敏感[4]。与记忆相关的神经元突触为胆碱能突触，胆碱能神经通路本身就参与了记忆痕迹的构成[5]。乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）是迄今发现的与学习、记忆关系最为密切的一种神经递质，脑组织内ACh的含量可作为显示胆碱能神经元功能的一项特异性指标，与学习、记忆的增强呈量效关系[6]。胆碱乙酰基转移酶（ChAT）由胆碱能神经元合成，是合成ACh的限速酶，与ACh平行分布，常作为研究胆碱能神经元的标志或估计ACh含量(释放量)的间接指标[7]。

大豆异黄酮是—种天然的植物雌激素，是人膳食中最主要的植物雌激素来源，其结构与苯甲酸雌二醇相似，具有结合雌激素受体(ERs)的能力，从而表现出雌激素样活性。雌激素受体分为ERα和ERβ两种亚型，ERα受体多分布于生殖器官，ERβ受体则主要分布在非生殖组织，例如骨、脑、血管内皮、膀胱等[8]。而大豆异黄酮与雌激素受体的结合具有选择性，与ERβ受体的结合能力是ERα受体结合能力的20余倍[9]，因此提示大豆异黄酮对表达ERβ的组织影响更大。

为探讨改善VD的方法，本研究观察了大豆异黄酮对慢性脑缺血大鼠海马神经元ChAT表达的影响。结果发现，给予大豆异黄酮灌胃的治疗组大鼠，海马CA1区神经元ChAT蛋白的表达明显高于模型组大鼠，说明大豆异黄酮可通过增加慢性脑缺血大鼠海马神经元ChAT蛋白的表达，改善胆碱能神经元的功能。考虑其机制可能是大豆异黄酮通过与脑血管内皮ERβ受体结合，改善了慢性脑缺血大鼠海马微血管的功能，进而通过改善海马神经元的血液供应，缓解了缺血、缺氧对于神经元的损伤；同时，还可能是增加了海马神经元的能量供给及合成ACh原料的供应，从而发挥对海马胆碱能神经元的保护作用。

综上所述，大豆异黄酮对慢性脑缺血大鼠海马神经元具有保护作用，可能具有减轻慢性脑缺血所致学习记忆功能障碍的作用，其机制可能与上调海马神经元ChAT蛋白的表达有关。