新型恶唑烷酮化合物对耐药性结核分枝杆菌抗菌作用的探讨

化莉，赵亚静，朱贵荣

（1.北京大学国际医院 呼吸与危重症医学科，北京 102206；2.解放军第309医院呼吸科，北京 100091）

近年来，临床结核分枝杆菌的耐药率不断增加[1-2]。恶唑烷酮类化合物是新型抗菌剂，利奈唑胺（linezolid）是唯一被批准应用于临床的恶唑烷酮类药物[3]。然而，linezolid用药会引起神经、视力及血液等毒副作用，因此医药学界一直致力于发现活性更高、毒性更弱的新型恶唑烷酮化合物[4]。本文针对临床分离的多重耐药及广泛耐药结核分枝杆菌，通过体外和动物模型两种不同层面评价新型恶唑烷酮及linezolid的抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 菌株和试剂

选取2012年1月-2016年1月309医院收治肺结核患者。17株多重耐药结核分枝杆菌（multi-drug resistance tuberculosis, MDR-TB）和10株广泛耐药结核分枝杆菌（extensive drug resistance tuberculosis,XDR-TB）。以标准菌株H37RV作为质控菌株（购自中国药品生物制品研究所）。Linezolid及新型恶唑烷酮化合物（sy-40、sy-41、sy-142、sy-144）均由中国药科大学制药学院合成。

1.2 结核分枝杆菌培养和药物活性检测

1.2.1 结核分枝杆菌分离培养 采用米氏琼脂培养基，其制备见相关报道。痰标本用2% NaOH液化，作用20 min后，以无菌吸管取0.2 ml分别接种于斜面上，置37℃温箱内培养，每周观察。

1.2.2 药物活性检测 Linezolid及新型恶唑烷酮化合物以倍比稀释配置0.125～32.000 μg/ml。将上述配好的药物溶液按相应比例加入到含有OADC营养添加剂（油酸、牛血清蛋白、右旋糖苷及过氧化氢酶）的Middlebrook 7H10琼脂培养基中。刮取约10 mg生长物，研磨均匀后，用蒸馏水稀释至1 μg/ml，各取0.1 ml接种于含药斜面和对照斜面，置于36℃温箱培养21 d，测定其最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。利用测定最低抑菌浓度（MIC）以上各试验管培养物，分别吸取0.1 ml，移种在不含药物的培养基上，经孵育培养21 d，菌落数＜5个的药物浓度为最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）。

1.2.3 动物模型活体抗结核活性测试 将0.2 ml含有5×106个活菌的H37Rv及临床分离株（MDR和XDRTB）菌悬液通过尾静脉注射的方式感染BALB/c小鼠。将测试化合物溶于磷酸盐缓冲液中，配成50 mg/ml的溶液。以胃灌方式每天给药1次，恶唑烷酮的灌胃药物浓度为100 mg/kg，利福平（rifampicin, RFP）的灌胃浓度是10 mg/kg。每组8只小鼠，不给药的小鼠作阴性对照。持续给药1个月后，解剖小鼠，取肺组织进行HE染色，并测定全肺的结核分枝杆菌活菌计数。实验动物室注册批文：SYXK（军）2012-0016。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计量资料多组比较使用方差齐性检验，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Linezolid及新型化合物对结核分枝杆菌抗菌活性分析

Linezolid及新型化合物体外抗结核MIC值见表1。对17例MDR-TB及10例XDR-TB，化合物sy142、sy144及linezolid都体现出较低的MIC值。对于sy142，只有1例MDR-TB的MIC值为≥4 mg/L，而XDR-TB的MIC值均在2 mg/L及以下。从MIC分布上分析，sy142对MDR-TB及XDR-TB的体外抗菌效果要略优于linezolid，而sy144的活性与linezolid处在同一水平。Linezolid及新型化合物体外抗结核MBC值见表2。对于临床菌株，MBC的分布状况与MIC分布类似，sy142的效果同样略优于linezolid。

表1 Linezolid及新型化合物体外MIC检测

表2 Linezolid及新型化合物体外MBC检测

2.2 linezolid及新型恶唑烷酮化合物对小鼠体内结核分枝杆菌抗菌活性分析

选取sy142、sy144及linezolid进行小鼠体内抗结核治疗并分析比较其优劣差异。将BALB/c小鼠进行结核分枝杆菌攻毒感染1周后，对其进行linezolid、sy142、sy144化合物灌胃治疗。1个月后，将小鼠进行解剖取肺，行HE染色抗酸染色及全肺菌落计数。HE染色后，蓝色细胞聚集区域为炎症区域，这部分区域面积越大表示炎症反应越高。结果显示，未治疗对照组肺部出现大量的炎症细胞（见附图A），说明感染成功。Linezolid、sy142及sy144治疗组中的炎性细胞区域少于对照组，而sy142治疗组的炎症区域面积较Linezolid治疗组的炎症区域面积小，结果差异有统计学意义（见附图B～D，F）。而未感染的阴性对照组，并未出现明显的炎症细胞区域（见附图E）。同时，肺部菌落计数结果显示，linezolid、sy142、sy144及 RFP 治疗对 H37Rv（F=11.34，P=0.000）、MDR（F=14.58，P=0.000）、XDR（F=8.82，P=0.000）菌株治疗差异有统计学意义。进一步两两比较显示，sy142治疗组菌落计数低于linezolid治疗组及sy144治疗组，结果差异有统计学意义。利福平（RFP）对标准菌株H37Rv具有明显的活性，但对MDR及XDR-TB均不具有明显活性（见表3）。

附图 不同化合物治疗结核感染小鼠染色分析（HE×10倍）

表3 linezolid、sy142、sy144及RFP动物体内抗结核活性差异比较

3 讨论

恶唑烷酮类化合物是新型的抗生素，对革兰阳性球菌、结核分枝杆菌等都具有良好的活性。在应用初期针对MDSA及XDR-TB取得较好的治疗效果。Linezolid长期使用会产生很强的副作用，如神经毒性休克及血小板减少症等。由于抗结核治疗周期往往需要半年以上，因此linezolid的毒副作用制约其在抗结核领域的应用。因此，很多药物化学家致力于开发研制毒副作用更低、抗菌谱更广、活性更强的新型二代恶唑烷酮类新药[5]。

目前在研的二代恶唑烷酮类化合物包括AZD-2563[6]、RANBEZOLID[7]、DA7867 等[8]。不同的新型制剂都具有某些自己独到的优势和不足。AZD-2563由Astrazeneca公司研发并已经进入一期临床研究。其活性较linezolid有所提高，并且能够产生长期持久的效果。但由于未知原因，临床研究被中断，而临床研究数据并未被公布。Ranbezolid活性是linezolid的2倍，在体内也具有良好的药代动力学和安全性，但曾有文章报道，含有硝基呋喃基团的化合物可被体内酶类催化，将硝基转化为亚硝基自由基中间体，从而产生细胞毒性，因此Ranbezolid也于一期临床研究后被中断。

在小鼠感染模型中，linezolid，sy142和sy144可以杀灭肺部感染结核分枝杆菌。sy142无论在控制炎性区域面积和直接抑菌作用均强于linezolid，这初步预证了sy142在活体条件下的抗结核活性前景。但具体是否能成为新一类上市药物，还需要药代动力学、安全性、稳定性等大量数据支持。与linezolid的结构比较发现，4哌嗪基被N-杂环取代会提高抗结核活性。所以后续的基于该点的结构改造也至关重要。笔者的发现很有可能成为研发抗广泛耐药结核新药的先导化合物。