程序性死亡配体-1在食管鳞癌中的表达及临床意义

姚童翔，原翔，刘怡文，夏金，张耀文，李剑，周福有

[1.新乡医学院，河南 新乡 453003；2.河南省肿瘤表观遗传重点实验室，河南 洛阳471003；3.河南科技大学第四附属医院（安阳市肿瘤医院）胸外科，河南 安阳 455000]

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，中国疾病控制与预防中心数据显示，食管癌在我国的每年发病人数约为22万人以上，死亡人数每年则高达19+万人[1]。食管 鳞 癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是亚洲食管癌的主要病理类型，约占食管癌的90%以上[2]，河南省林州市及其毗邻的辉县，安阳等地是我国，也是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区[3]。大多数患者确诊时已属晚期或伴有远处转移，预后差，5年生存率极低[4]。肿瘤免疫抑制在促进肿瘤发展的同时减弱抗肿瘤治疗的疗效[5]，程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1, PD-L1）是一个主要的调控免疫抑制的分子，PD-L1属于B7超家族，主要在T细胞、B细胞、树突状细胞、炎症反应细胞和恶性肿瘤细胞中表达[6]，与程序性死亡-1（programmed cell death-1, PD1）结合后可以提供抑制性信号，抑制T细胞的活化和增殖，诱导T细胞凋亡，使肿瘤细胞逃避免疫杀伤[7]，PD-L1高表达于各种实体恶性肿瘤，并且可诱导T淋巴细胞的凋亡[8]，抗PD1/PD-L1通路的药物在在黑色素瘤、非小细胞肺癌等领域取得很大的成功[9]，本研究将分析PD-L1在50例食管鳞癌患者中表达特征和其临床意义及预后价值。

1 资料与方法

1.1 一般研究

选取2014年1月-2014年6月于河南科技大学第四附属医院（安阳市肿瘤医院）接受手术治疗的食管癌患者，50例食管鳞癌组织及相应癌旁组织（距肿瘤切缘＞5 cm）标本，全部患者均经病理学确诊为食管鳞癌。男31例、女19例；年龄42～79岁，平均（61.3±8.3）岁；高分化+中分化40例、低分化10例；根据美国癌症联合会（AJCC）食管癌第7版TNM分期标准：Ⅰ期8例、Ⅱ期29例、Ⅲ期13例；发生淋巴结转移13例。所有患者术前均未接受放化疗及免疫治疗，并于术前获得患者书面知情同意。该项目通过医院伦理委员会的同意。

1.2 免疫组织化学检测PD-L1

采用免疫组织化学（简称免疫组化）SP超敏试剂盒（中杉金桥产品编号SP-9000）检测食管癌及其相应癌旁组织中PD-L1（抗兔单克隆抗体1∶200，Abcam）的表达。由2位副高职称以上的病理医师双盲阅片，随机挑选5个高倍镜视野观察，根据染色强度（0，阴性；1，弱阳性；2，中度阳性；3，强阳性）和阳性肿瘤细胞数（0，＜5%；1，5%～25%；2，25%～75%；3，≥75%）乘积对每个视野进行免疫评分：0为阴性；1～12为阳性，5个视野免疫评分均值为最终结果。

1.3 Western blot检测PD-L1

提取组织蛋白后，用BCA法进行蛋白定量（康为）。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行上层胶恒压90 V/30 min，下层胶恒压120 V/60 min电泳，切胶后采用“三明治夹心法”，恒压90 V/150 min转膜，5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，TBST清洗1次，30 s/次，加入PD-L1兔一抗（1∶1 000，Abcam）和内参GAPDH（1∶2 000康为）4℃过夜，TBST清洗3次，5 min/次，加入兔二抗（1∶2 000，康为）室温孵育2 h，再用TBST漂洗3次，5 min/次，ECL（美国invitrogen公司）处理PVDF膜后用凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）检测目的蛋白条带，Image Lab软件对蛋白条带灰度进行定量分析。

1.4 随访

50例食管鳞癌患者术后随访时间30个月。生存时间定义为手术日期至最后一次随访日期或死亡，未删失数据为由食管癌导致的死亡患者，删失数据为随访至30个月仍存活患者。

1.5 统计学方法

数据进分析采用SPSS 23.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用配对t检验；计量资料采用χ2检验。应用Kaplan-Meier绘制生存曲线并以Log-rank检验生存时间之间差异，单因素分析应用Log-rank检验，多因素Cox回归计算风险比例（hazard ratios, HR）及其95%CI，分析各因素对食管鳞癌预后的影响，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌与癌旁组织中PD-L1蛋白的表达情况

PD-L1的阳性表达为胞膜出现棕黄色颗粒，部分胞浆也有表达。部分食管鳞癌及癌旁组织中可见PD-L1阳性表达。食管鳞癌组织组与相应癌旁组织组比较，差异有统计学意义（χ2=13.848，P=0.006），食管鳞癌组织中PD-L1阳性表达率高于相应癌旁组织组，且随着分化程度的降低，PD-L1免疫组化评分逐渐升高。见表1和图1。

表1 组织样本中PD-L1蛋白表达

图1 食管鳞癌中PD-L1的表达 （IHC×400）

2.2 食管癌与癌旁组织中PD-L1蛋白的表达

PD-L1蛋白的分子量约为33 kD。应用Image lab软件将灰度值进行定量分析，并对结果进行统计学分析，食管鳞癌组织组与相应癌旁组织组比较，差异有统计学意义（t=3.612，P=0.000），食管鳞癌组织组PD-L1蛋白表达（灰度均值为4.086±1.060）高于相应癌旁组织组（灰度均值为1.884±0.642）。见图2。

2.3 PD-L1蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的相关性

PD-L1蛋白表达与肿瘤浸润深度及临床分期相关。见表2。

2.4 PD-L1蛋白表达水平与食管鳞癌患者预后

50例食管鳞癌患者术后30个月的总生存率为66%；PD-L1阳性表达组30个月生存率（38.1%）低于阴性组（86.2%）（χ2=14.311，P=0.000）。见图 3。

图2 食管鳞癌及相应癌旁组织中PD-L1蛋白表达

表2 PD-L1蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的相关性例（%）

分化程度、淋巴结转移、TNM分期及PD-L1蛋白表达与食管鳞癌患者生存预后相关（见表3）。多变量Cox回归分析结果显示，淋巴结转移与PD-L1表达是食管鳞癌患者生存的预后因素。见表4。

表3 食管鳞癌患者预后Log-rank检验

表4 食管鳞癌患者预后的多因素Cox回归分析

图3 食管鳞癌患者Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生、发展过程中的关键环节。肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）被认为是机体对肿瘤细胞特异性免疫反应的效应细胞[10]，临床研究表明，TIL在肿瘤（包括食管癌）中发挥关键作用并具有预后意义[11]。由于肿瘤组织不表达或极少量表达MHCⅡ类分子，因此认为抗肿瘤特异性免疫的效应细胞主要为CD8+T细胞，肿瘤特异性CD8+T细胞均高表达PD1，同时许多肿瘤细胞高表达PD-L1分子[12]，PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞表达的PD1结合后，可导致PD1胞质区的免疫受体酪氨酸转化基序（ITSM）结构域磷酸化，导致下游信号受到抑制，阻断Akt和PI3K的活性，干扰IL-2的分泌，减弱TCR/CD28信号对免疫细胞的活化作用[13]，最终抑制T淋巴细胞增殖和相关细胞因子的分泌，进而抑制机体的抗肿瘤免疫。除了能直接抑制TIL的功能外，PD-L1还可以通过调节T细胞分化调节抗肿瘤免疫，研究[14]表明，CD4+CD25+Foxp3+Treg是具免疫负性调节功能的细胞群，通过细胞分泌白介素10、转化生长因子β等免疫负性细胞因子抑制免疫应答。PD-L1可促进CD4+CD25+Foxp3-T向CD4+CD25+Foxp3+Treg转化[15]，使用单克隆抗体阻断PD-L1，可减少Treg产生，并且Treg凋亡加速。GENG等[16]发现，PD-L1能有效促进Treg分泌白介素10，进而发挥免疫抑制作用。本研究均表明PD-L1在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用。

肿瘤浸润和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征，也是影响肿瘤患者预后的主要因素。上皮细胞间质化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指上皮细胞失去极性，细胞间紧密连接及黏附连接消失，变成了具有间质细胞形态和功能的细胞，Ⅲ型EMT与肿瘤的浸润和转移有关[17]，人体90%以上恶性肿瘤是上皮性肿瘤，由于EMT是上皮细胞获得迁移能力的有效途径，因此EMT成为癌症浸润转移的重要途径之一。CAO等[18]在小鼠皮肤肿瘤模型中发现，PD-L1可促进肿瘤细胞中转录因子Slug和Twist的表达，抑制上皮性钙粘蛋白（E-cadherin）的表达，从而促进EMT的发生，同时在体内实验也证实了PD-L1的过表达可促进EMT的发生。cop9信号小体5（cop9 signalosome 5,CNS5）是CNS的重要组成部分，能增强肿瘤的侵袭、转移能力[19]，LIM等[20]通过构建乳腺癌模型，发现肿瘤坏死因子（TNF-α）通过活化p65，促进CSN5表达，CSN5和PD-L1结合后，可使PD-L1去泛素化，增强PD-L1稳定性。本研究表明PD-L1在肿瘤的侵袭、转移过程中起到重要作用。

本研究表明，PD-L1在食管癌组织的表达高于其相应癌旁组织，这与CHEN[4]、OHIGASHIO[21]研究结果一致。CHEN[22]通过免疫组化检测PD-L1在食管癌细胞的表达情况，显示PD-L1主要在细胞浆和细胞膜表达，部分细胞核也有表达，但本组资料仅检测到PD-L1在细胞浆和细胞膜表达。本研究显示，PD-L1的表达水平与食管癌患者性别、年龄、分化程度、区域淋巴结转移无相关性，而与浸润范围、TNM分期相关。PD-L1高表达患者比低表达患者的死亡风险更高，Cox回归分析结果显示PDL是食管癌独立预后因素，与CHEN[22]、LOOS等[23]结果一致。

PD-L1在食管鳞癌的发生、发展中发挥重要作用，可作为食管鳞癌预后判断的潜在指标。PD1/PD-L1通路的激活可导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，使肿瘤发生免疫逃逸，而阻断PD1/PDL信号通路可以逆转肿瘤免疫微环境，增强内源性抗肿瘤免疫效应[24]。因此，探讨PD-L1与食管鳞癌发生、发展的关系，进一步研究PD-L1在食管鳞癌发生、发展中的分子机制，使之成为食管鳞癌治疗的新靶点，为食管癌开辟新的治疗途径。