瑞舒伐他汀对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌凋亡及相关基因表达的影响*

谢亚芹，李浩，赵娟，孟凡星，崔海鹏，李瑞香

（1.承德医学院 病理生理学教研室，河北 承德 067000；2.河北省承德市中心血站，河北 承德 067000）

近年来研究表明，瑞舒伐他汀除具有降脂作用之外，还可以通过改善血管内皮功能，抑制炎症反应的发生，抵抗氧化应激等方面发挥循环系统保护作用，降低心血管疾病的发病率及病死率[1-2]。然而瑞舒伐他汀在心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）中保护机制目前尚不明确。本研究通过观察大鼠MIRI过程中缺血心肌组织细胞凋亡的变化，选择瑞舒伐他汀作为保护剂，分析其对心肌细胞凋亡及相关调节基因表达的影响，为临床药物应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试药

6周龄雄性Wistar大鼠30只，体重（290±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京）-2016-0011，生产合格证：11400700127208。

瑞舒伐他汀钙片（10 mg）购自江苏省无锡市阿斯利康制药有限公司，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏（Roche）公司，B淋巴细胞瘤2基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、B淋巴细胞瘤2基因相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein, Bax）兔抗多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组织化学（简称免疫组化）染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）引物由上海生工生物工程技术公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 将30只大鼠随机分为3组：假手术组（Sham组）、心肌缺血再灌注组（MIRI组）、心肌缺血再灌注+瑞舒伐他汀组（MIRI+R组），每组10只。于造模前第7天开始，MIRI+R组给予瑞舒伐他汀5 mg/kg灌胃，同时Sham组及MIRI组给予同体积生理盐水灌胃，均为每日1次。

1.2.2 复制大鼠MIRI模型 参照文献[3-4]复制MIRI模型。大鼠采用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，连接小动物呼吸机进行辅助通气，调节呼吸机参数：呼吸频率70～80次/min，吸呼比1∶1.5，潮气量5～6 ml/kg。沿胸骨左缘开胸，在左心耳下2～3 mm处将左冠状动脉前降支结扎，阻断冠脉血流。血流阻断成功的标准：以缺血动脉远端心肌表现为苍白，心电图（采用BL-420多媒体生物信号记录仪测量）呈现ST段上抬，QRS波幅增大，T波高耸或倒置作为血流阻断成功的标准。冠脉血流阻断30 min后，将结扎线剪开，进行120 min的再灌注。Sham组只穿线不结扎。

1.2.3 血流动力学参数检测 经再灌注后由右颈总动脉进行逆行插管直至左心室，导管另一端接压力换能器输入BL-420多媒体生物信号记录仪系统，记录左心室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure,LVEDP），左心室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax）等血流动力学参数。

1.2.4 标本制备 再灌注完成后快速留取左心室梗死部位标本，放入4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡和包埋用于病理学检测；另取部分梗死部位心肌迅速投入液氮中保存，用于RT-PCR检测。

1.2.5 TUNEL原位检测细胞凋亡 将石蜡切片常规脱蜡至水处理后，按照试剂盒说明书操作进行染色。凋亡指数（apoptotic index, AI）：以TUNEL阳性细胞数量与同一视野心肌细胞总数的比值作为左心室心肌细胞凋亡指数。

1.2.6 免疫组化检测左心室心肌组织Bcl-2、Bax蛋白水平 Ⅰ抗（Bcl-2、Bax多克隆抗体），稀释浓度均为1∶100。采用MiVnt图像分析系统半定量分析对结果进行分析，在200倍显微镜下以免疫阳性产物面积与视野面积的比值表示该抗原的相对含量。

1.2.7 RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA水平 准确称取心肌组织100 mg，按Trizol说明书提取组织总RNA，经RNA浓度和纯度测定后，进行逆转录。按试剂盒说明书操作。Bax引物序列：正向5'-TTTCATCCAGGATCGAGCAG-3'，反向 5'-CAAAGT AGAAGAGGGCAACCAC-3'；Bcl-2引物序列：正向5'-GACGAGAAGTGCTATTGGT-3'，反向 5'-TCAGGCTGG AAGGAGAAGAT-3'；β-肌动蛋白（β-actin）引物序列：正向5'-GAGAGGGAAATCGTGCG-3'，反向5'-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3'。Bax、Bcl-2、β-actin扩增产物大小分别为263、205及452 bp。采用Quantity One-v4.6.2软件进行定量分析，以β-actin为内参照，目的基因表达水平以其吸光度（A）与内参照β-actin A的比值表示。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瑞舒伐他汀对MIRI大鼠血流动力学参数的影响

各组大鼠血流动力学参数变化，差异有统计学意 义（P＜0.05）；Sham 组 与 MIRI组 LVEDP、±dp/dtmax比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MIRI组大鼠LVEDP水平升高、±dp/dtmax水平下降。

MRI组与MIRI+R组LVEDP、±dp/dtmax比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MIRI+R组大鼠LVEDP水平降低、±dp/dtmax水平升高。见表1。

2.2 心肌细胞凋亡检测结果

各组大鼠心肌细胞AI比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；Sham组与MIRI组AI比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MIRI组心肌细胞凋亡增高；MRI组与MIRI+R组AI比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MIRI+R组心肌细胞凋亡降低。见表1和图1。

2.3 心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达结果

各组大鼠Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比值，差异有统计学意义（P＜0.05）。Sham组与MIRI组Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MIRI组Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值降低。

表1 各组大鼠血流动力学参数及AI比较 （n =10，±s）

表1 各组大鼠血流动力学参数及AI比较 （n =10，±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与MIRI组比较，P ＜0.05

组别 LVEDP/mmHg +dp/dtmax/（mmHg/s） -dp/dtmax/（mmHg/s） AI Sham 组 4.76±0.95 4 755.46±214.51 3 729.44±277.52 0.080±0.012 MIRI组 15.64±2.051） 3 806.86±161.971） 2 721.71±223.251） 0.366±0.0361）MIRI+R组 9.78±0.482） 4 300.93±247.392） 3 350.22±195.572） 0.243±0.0242）F值 49.736 15.181 14.121 90.628 P值 0.000 0.004 0.005 0.000

图1 瑞舒伐他汀对MIRI大鼠心肌细胞凋亡的影响 （TUNEL×400）

MIRI组与MIRI+R组Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MIRI+R组Bax蛋白表达下降，Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值升高。见表2。

2.4 心肌组织Bcl-2、Bax mRNA表达结果

各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA表达及Bcl-2/Bax比值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Sham组与MIRI组Bcl-2、Bax mRNA表达及Bcl-2/Bax比值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MIRI组Bax mRNA表达升高，Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax比值降低。

MIRI组与MIRI+R组Bcl-2、Bax mRNA表达及Bcl-2/Bax比值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MIRI+R组Bax mRNA表达下降，Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax比值升高。见表3和图2。

表2 各组大鼠左心室心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达（n =10，±s）

表2 各组大鼠左心室心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达（n =10，±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与MIRI组比较，P ＜0.05

组别 Bcl-2蛋白 Bax蛋白 Bcl-2/Bax Sham 组 0.085±0.011 0.025±0.006 3.492±0.323 MIRI组 0.034±0.0121） 0.088±0.0101） 0.394±0.1501）MIRI+R 组 0.065±0.0142） 0.059±0.0082） 1.101±0.1682）F值 12.683 45.265 152.936 P值 0.007 0.000 0.000

表3 各组大鼠左心室心肌组织Bcl-2、Bax mRNA表达（n =10，±s）

表3 各组大鼠左心室心肌组织Bcl-2、Bax mRNA表达（n =10，±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与MIRI组比较，P ＜0.05

组别 Bcl-2 mRNA Bax mRNA Bcl-2/Bax Sham 组 0.455±0.064 0.220±0.026 2.087±0.380 MIRI组 0.111±0.0191） 0.660±0.0791） 0.168±0.2381）MIRI+R组 0.228±0.0352） 0.450±0.0452） 0.511±0.1052）F值 81.456 80.178 100.502 P值 0.000 0.000 0.000

图2 瑞舒伐他汀对MIRI大鼠心肌组织Bcl-2、Bax mRNA表达的影响

3 讨论

急性心肌梗死等缺血性心脏病目前在临床主要采用的溶栓、介入以及搭桥手术等手段进行治疗，能够尽快恢复缺血心肌的血流，减少心肌梗死范围，然而研究发现心肌缺血再灌注后，伴随着活性氧的产生、中性粒细胞被活化等改变，最终可导致炎症的出现、心肌细胞的损伤甚至细胞凋亡的发生[5-6]。因此认为心肌细胞凋亡与MIRI密切相关，是MIRI过程当中的标志事件[7]。如何降低心肌凋亡细胞的数目，保护心肌细胞结构和功能，减小梗死周边危险区的面积已成为近年来心血管领域研究的热点[8]。MIRI心肌细胞凋亡的发生机制十分复杂，其过程需要多种凋亡相关基因共同调控得以完成，其中Bcl-2和Bax被认为是一组重要的细胞凋亡调控基因[9]。Bax可以促进细胞凋亡，而Bcl-2则是抑制细胞凋亡的基因，凋亡细胞内两者的平衡状态直接影响细胞凋亡的调控。因此，Bcl-2和Bax两者在细胞中的含量和功能间的平衡是细胞在受到凋亡刺激后细胞死亡或存活的重要机制[10]。本研究中血流动力学参数显示，MIRI组LVEDP水平增高，+dp/dtmax与-dp/dtmax则降低，表明心肌发生缺血再灌注过程中出现了心功能的恶化。TUNEL细胞凋亡检测结果显示，在MIRI组AI增高，并且凋亡相关基因Bax表达升高，Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值降低，提示在心肌细胞凋亡可能是造成MIRI的重要机制之一，且相关的凋亡基因Bcl-2、Bax参与了该凋亡的调控过程。

他汀类药物作为应用最为普遍的调脂药物，已成为治疗高脂血症及防治动脉粥样硬化性疾病的基石。其作用机制主要通过与3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）竞争性结合酶的活性部位从而阻碍HMG-CoA还原酶的作用，阻断甲羟戊酸的代谢途径，最终抑制甲羟戊酸的合成。目前发现他汀类药物不仅具有降低血脂、改善动脉粥样硬化等作用，还可以发挥抗炎、改善血管内皮细胞的功能、抗氧化应激、抑制心肌肥厚等多种功能[11]。研究发现瑞舒伐他汀可减轻MIRI过程中引起的心肌损伤，保护心室功能[12]。本研究结果显示，给予瑞舒伐他汀预处理后，心肌缺血再灌注的大鼠心功能明显好转，心肌细胞AI降低，促凋亡基因Bax mRNA表达降低，而抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表达增加，提示瑞舒伐他汀对再灌注损伤心肌的保护作用，而对心肌细胞凋亡的抑制作用可能是其发挥作用的机制之一。然而MIRI的发病机制十分复杂，其中涉及诸多信号传导通路及内源性、外源性因子，因此瑞舒伐他汀对于MIRI心肌的保护机制有待进一步研究。