纤维蛋白原Bβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多态性与慢性阻塞性肺疾病急性加重期的相关性研究

慢性阻塞性肺疾病(COPD)为一种常见的慢性气道性疾病，临床上表现为进行性加重的呼吸困难，随着疾病进展，可以并发呼吸衰竭、肺心病等，导致病人死亡，预计到2020年该病将会成为全球第三位主要的死亡原因和第五位主要的致残原因[1-5]。研究表明，病人反复急性加重是疾病进展的主要危险因素，其发作频率约为每年2.4～3次。目前针对预测COPD急性加重(AECOPD)的生物学标志物的研究多集中在血清炎症因子，部分研究发现纤维蛋白原(Fg)水平在AECOPD病人中增高，分析可能与AECOPD病人血液黏稠度增高、存在炎症导致病人血管内皮功能受损有关。但未见Fg基因多态性和AECOPD的相关性研究的报道。目前有研究表明，FgBβ链基因的10余个多态性位点中，FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A位点可能与血管内皮损伤有关[6-10]。

因此，本研究探讨FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多态性与AECOPD的关系，为早期识别AECOPD高风险人群提供依据，以便临床医师早期干预。

1 对象和方法

1.1 研究对象 纳入标准：根据中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组COPD诊治指南(2013年修订版)中关于COPD的定义[1]，选择符合诊断标准的COPD病人80例作为病例组，同时选择年龄、性别、吸烟史与之相匹配的健康体检者100例作为对照组。根据上一年度急性加重次数划分亚组，其中≥2次/年为急性加重亚组，<2次/年为非急性加重亚组。病例组男51例，女29例，年龄67～71岁，平均(69.17±2.87)岁，平均吸烟(5.91±3.12)年，对照组男68例，女32例，年龄66～72岁，平均(69.00±3.12)岁，平均吸烟(5.56±4.91)年。

排除标准：(1)合并严重肝肾疾病、恶性肿瘤及血液系统疾病病人；(2)合并严重心脏疾病及心律失常病人；(3)应用抗凝药物病人。

1.2 研究方法 2组病人入组后均抽取清晨空腹静脉血检测Fg水平，同时抗凝管采血3 mL，低渗法分离白细胞后，应用酚/氯仿法提取DNA，应用多聚合酶链反应(PCR)扩增目的DNA，限制性内切酶酶切扩增产物，将酶切产物在8%(质量浓度)非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，检测FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多态性位点的基因型。比较2组病人Fg水平及两个位点基因型分布频率及等位基因分布频率。

2 结果

2.1 FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因位点多态性电泳结果 PCR扩增FgBβ-249C/T基因T纯合子(T/T)产物片段长度为311 bp；C纯合子(C/C)产物片段长度为249 bp和62 bp；CT杂合子(C/T)产物片段长度为311 bp、249 bp和62 bp，因62 bp的片段分子量小，泳动速度较快，已经跑出胶外，因此图中未显示。PCR扩增FgBβ-854G/A基因A纯合子(A/A)产物片段长度为114 bp；G纯合子(G/G)产物片段长度为90 bp和24 bp；GA杂合子(G/A)产物片段长度为114 bp、90 bp和24 bp。因24 bp的片段分子量小，泳动速度较快，已经跑出胶外，因此图中未显示。见图1，2。

2.2 2组血浆Fg水平比较 与对照组相比，病例组血浆Fg水平明显增高[(275.81±49.99)mg/dL比(418.51± 154.00)mg/dL,t=7.959 ,P<0.05]。在病例组中，急性加重与非急性加重亚组比较，血浆Fg水平无明显差异[(412.02±146.61)mg/dL比(431.26±169.76)mg/dL,t=0.5269 ,P=0.106]。

图1 FgBβ-249C/T电泳结果

图2 FgBβ-854G/A电泳结果

2.3 FgBβ-249及FgBβ-854基因多态类型及等位基因比较 病例组FgBβ-854 GA型突变率高于对照组(25.0%比4.0%，P<0.01)；病例组FgBβ-249 CT型突变率高于对照组CT型突变率(56.2%比27.0%，P<0.01)；FgBβ-854G/A及FgBβ-249C/T等位基因分布频率在病例组及对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4 各亚组间FgBβ-249及FgBβ-854基因分布频率及突变率比较 与非急性加重亚组比较，急性加重亚组FgBβ-854G/A基因型GG型、GA型、AA型分布频率差异无统计学意义(P>0.05)；FgBβ-249C/T基因型CT型、TT型分布频率差异存在统计学意义(P<0.01)。见表2。

3 讨论

COPD临床上表现为进行性加重的呼吸困难，病理生理上主要表现为进行性加重的气流受限。随着疾病进展，可以并发呼吸衰竭、肺心病等，导致病人死亡及残疾，严重影响病人生活质量[1-4]。

表1 FgBβ-249及FgBβ-854基因型频率及等位基因频率比较

注：与对照组比较，**P<0.01

表2 急性加重与无急性加重亚组间FgBβ-249及FgBβ-854基因分布频率及突变率比较(n,%)

注：与非急性加重亚组比较，**P<0.01

在之前研究中发现，Fgβ链基因的10余个多态性位点中，Bβ-249C/T和Bβ-854G/A位点可能分别与血管内皮损伤有关。血管内皮受损，一方面可以导致体内凝血异常，出现微小血栓形成，影响组织血供；另一方面，血管内皮损伤可以引起部分炎症因子释放[11-14]，引发体内炎症反应。AECOPD病人由于肺部及全身炎症反应，可以导致血管内皮损伤及凝血功能异常，导致体内高凝状态形成。本研究发现，与对照组相比，病例组血浆Fg水平明显增高，这与既往研究结果一致。但在病例组中，急性加重与非急性加重亚组比较，血浆Fg水平无明显差异，分析该项结果可能与病人数量较少有关。下一步研究应进一步扩大研究病人数量。

FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A位点导致的血管内皮损伤进一步引发COPD病人体内炎症反应及凝血异常，从而出现恶性循环。本研究发现，病例组FgBβ-854 GA型突变率高于对照组(25.0%比4.0%，P<0.05)；病例组FgBβ-249 CT型突变率高于对照组(56.2%比27.0%，P<0.05)；FgBβ-854G/A及FgBβ-249C/T等位基因分布频率在病例组及对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。与非急性加重亚组比较，急性加重亚组FgBβ-249CT型、TT型分布频率差异有统计学意义(P<0.01)。这提示FgBβ-249C/T位点突变率和AECOPD相关。

因此，针对COPD病人检测FgBβ-249C/T位点突变率有助于预测AECOPD风险，有助于临床医生及早给予干预，减少病人急性加重次数，减轻病人因急性加重导致的肺功能下降及住院增加的经济负担，具有较好的应用前景。但本研究存在以下局限性：一方面本研究为回顾性研究，未进行前瞻性研究，需进一步明确FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因对于AECOPD风险的预测作用；另一方面，本研究入组人数偏少，有可能不能反映群体FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因分布情况。因此，下一步的研究中，需要进一步扩大样本量，同时开展前瞻性研究，进一步探讨FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多态性与AECOPD的相关性。