Hemorphin-4在中枢上水平对小鼠热板法痛阈和排便的调节

张兆伟,秦妮娜,陈 锴,邹雨霞

(延安大学附属医院 麻醉科,陕西 延安716000)

吗啡、芬太尼等传统阿片类药物，多是μ阿片受体的选择性激动剂。然而，μ阿片受体的激活，常常会诱发耐受、便秘、呼吸抑制等副作用，致使其应用和推广受到极大限制[1,2]。近期研究发现，阿片受体之间可能存在一定的协同调节(增强镇痛且减少副作用)，阿片受体的多功能配体受到广泛关注[3-5]。阿片样肽hemorphin-4(Tyr-Pro-Trp-Thr)，是牛血红蛋白β链的四肽片段，对μ、δ、κ阿片受体都有较高的亲和性[6]。侧脑室注射hemorphin-4(25-75 μg)，在小鼠温水浴甩尾实验中表现出显著的镇痛作用，而50 μg的hemorphin-4对小鼠的胃肠推进没有任何影响，意味着hemorphin-4在发挥显著镇痛时不会诱发胃肠动力障碍[7]。因此，本实验通过热板模型和排便实验，更进一步地评价hemorphin-4在中枢上水平对热痛和排便的调节。

1 材料与方法

1.1材料

昆明系小鼠购自成都达硕生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(川)2013-24。Hemorphin-4通过固相多肽合成法合成，RT-HPLC进行分析纯化。Naloxone购于Tocris公司。戊巴比妥钠购于Sigma公司。

1.2给药方式

侧脑室埋管参考之前的报道[8]。腹腔注射戊巴比妥钠(70 mg/kg)麻醉小鼠，并置于脑立体定位仪，以Bregma点为参考(后移0.6 mm、侧移1.2 mm、深1.7 mm)，将26 G不锈钢套管固定于脑颅骨。单只单笼饲养5-7天后，进行后续实验。利用微量进样泵注射(3 μL/2 min)，留针1 min防止回流。实验结束后，注射蓝墨水检测埋管位置。

1.3热板模型

因雄性小鼠的睾丸易受热下垂致其跳跃，我们选择雌性小鼠，并记录其“舔后爪”的潜伏时间。基于前期预备工作，55.5 ℃的热板使得大多数小鼠在5-10 s出现舔后足，剔除过于敏感或迟钝的小鼠。为避免组织烫伤，将截至时间定为30 s。本实验，以3次给药前痛阈值的平均数为该只小鼠的基础痛阈值，以侧脑室给药后5 min、10 min、20 min、40 min时的潜伏时间为给药后痛阈值，参考下述公式计算最大镇痛效应百分率(MPE %)：MPE %=(给药后痛阈值-基础痛阈值)/(30-基础痛阈值)×100 %。

1.4排便实验

排便实验，可以更好地反映便秘症状。参考之前的报道[9]，以给药后30 min内粪便颗粒数和总干重来评价药物对排便的调节。实验的关键在于，在埋管小鼠的恢复期，务必让小鼠充分适应实验员，以避免捉拿以及侧脑室注射刺激小鼠排便。

1.5数据分析

数据以“平均值±标准差”表示，用单因素方差分析中的Bonferroni法进行组间比较，P<0.05表示差异具有显著性。每个实验组至少5-7只小鼠。

2 结果

2.1Hemorphin-4在热板模型中的镇痛作用

如图1所示，在热板模型中，侧脑室注射hemorphin-4(3-30 μg)表现出显著的剂量和时间依赖性的镇痛作用，而且在10 min时出现了镇痛的峰值。因此，我们选择10 min时的镇痛效果为代表，更详细地比较给药前后小鼠痛阈值的变化(表1)。相较于基础痛阈值，侧脑室注射生理盐水对舔后足潜伏期没有影响。与之相比，即使小剂量的hemorphin-4(3 μg)也可以显著地延迟小鼠的舔后足潜伏期，而在10 μg和30 μg的剂量时，小鼠的舔后足潜伏期甚至延迟了2-3倍，呈现出一定的剂量依赖性。

图1侧脑室注射hemorphin-4(3-30μg)调节热板致痛小鼠的舔足潜伏期。每组至少6只小鼠，数据以最大镇痛效应百分率(MPE%)的“平均值±标准差”表示。***P<0.001，**P<0.01，表明hemorphin-4与生理盐水具有统计学意义上的差异。

表1 Hemorphin-4对热板致痛小鼠的镇痛(T=10 min)

2.2Naloxone对hemorphin-4镇痛的影响

为探究hemorphin-4的镇痛机制，我们提前10 min皮下注射阿片受体的非选择性拮抗剂naloxone(2 mg/kg)。如表2所示，与“生理盐水+生理盐水”组相比，naloxone预处理对中枢注射生理盐水的痛阈值没有影响，却能够非常显著地阻断30 μg hemorphin-4所引起的镇痛。

2.3Hemorphin-4对小鼠排便的调节

由表3可以看出，与生理盐水组相比，30 μg 的hemorphin-4对粪便颗粒数量及干重没有影响，而只有高剂量的hemorphin-4(100 μg)才能够有效地抑制小鼠的正常排便。

表2 Naloxone对hemorphin-4(30 μg)镇痛的影响

#，表示与“生理盐水+生理盐水”相比$，表示与“生理盐水+Hemorphin-4”相比

表3 侧脑室注射hemorphin-4对小鼠排便的调节

3 讨论

甩尾反应属于脊髓调节的条件反射，而舔后足行为则有延髓等高位中枢的参与，这是甩尾模型与热板模型的本质区别。有文献报道显示，阿片类化合物PZM21对小鼠甩尾潜伏期没有影响，却显著且持久地延迟小鼠舔后足的潜伏期[9]。因此，基于hemorphin-4在甩尾模型中显著的镇痛作用，本实验拓展镇痛模型，探究hemorphin-4在中枢上水平对热板致痛小鼠的痛阈调节。

由表1可知，侧脑室注射hemorphin-4(3-30 μg)能够剂量依赖地延迟热板致痛小鼠舔后足的潜伏期。该镇痛作用几乎被naloxone完全阻断(表2)，表明hemorphin-4可能是通过阿片受体的激活发挥镇痛，这一结果与hemorphin-4关于受体亲和及甩尾镇痛的报道一致[6,7]。比较hemorphin-4在热板和甩尾两个模型中的镇痛活性，我们发现，10 μg hemorphin-4在热板模型中的镇痛效果略低于甩尾模型中50 μg hemorphin-4所产生的镇痛作用[7]。Hemorphin-4在热板模型中表现出更高的镇痛活性，虽然可能是小鼠的种系差别或性别差异等，但更关键的原因或许可归因为阿片受体在高位中枢有更集中的分布[2]。相较于hemorphin-4在热板模型中的显著镇痛，同等剂量的hemorphin-4(30 μg)对小鼠的正常排便没有影响，意味着hemorphin-4在发挥有效镇痛时不会诱发便秘，这或许与hemorphin-4的三重配体活性(μ、δ、κ阿片受体)有关。有关hemorphin-4在术后痛、神经痛等经典模型中的痛调节，及其对依赖、耐受、呼吸抑制等典型阿片副作用的调节，值得更进一步的探索。

总而言之，本研究结果显示，hemorphin-4在热板模型中表现出比甩尾模型更高的镇痛活性，在发挥镇痛作用时不会诱发便秘。