8种呼吸道感染病原体抗原片的研制及临床检测

包 洪，张晓刚，金玉芬，常 静，吴丽霞，于 庭*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春 130041； 2.北京英诺特生物技术有限公司；3.沈阳医学院附属第二医院)

呼吸道传染病是高发流行病，具有人群普遍易感，诱发原因广泛，传染性强，传播速度迅速，较难控制等特点[1]，如今呼吸道感染已占儿科门诊的60%以上。而快速高效地诊断出患者感染的呼吸道病原体类型有助于尽快确定治疗方案，防止病情加重和迁延不愈。血清学检测是临床常用的呼吸道传染病初步筛查、诊断方法。间接免疫荧光法是临床检测的经典及金标准实验[2]，因其方便、灵敏、特异、高效的特点常用于临床病原体的初步诊断。为此我们与北京英诺特生物技术有限公司合作，运用细胞培养技术，制备用于检测肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、甲型/乙型流感病毒(FluA/B)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、嗜肺军团菌(LP)血清1型共8种常见呼吸道病原体抗原片，并制备成试剂盒，现对此试剂盒进行性能评价。

1 材料与方法

1.1一般资料吉林大学第二医院2016年6月-2017年10月收治的呼吸道疾病感染患者。MP确诊患者240例，排除患者285例；CP确诊患者207例，排除患者313例；Flu A确诊患者262例，排除患者154例；Flu B确诊患者203例，排除患者282例；PIV确诊患者207例，排除患者260例；RSV确诊患者202例，排除患者359例；ADV确诊患者205例，排除患者258例；LP1确诊患者28例，排除患者288例。

1.2菌种来源肺炎支原体FH株，肺炎衣原体TW-183株；甲型流感病毒A/Taiwan/8949/2008(H1N1)株；乙型流感病毒B/Beijing/1/1987株；副流感病毒1、2、3型分别为HPIV1/USA/32193A/2010，HPIV-06-25，HPIV-06-4株；呼吸道合胞病毒Long株；腺病毒3型和嗜肺军团菌1型L10/23株均由北华大学提供。

1.3试剂与仪器日本奥林巴斯荧光显微镜。西班牙VIRCELL,S.L公司生产的九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒(间接免疫荧光法)，北京英诺特生物技术有限公司生产的呼吸道感染病原体抗体IgM检测试剂盒(间接免疫荧光法)。

1.4病原体抗原片的制备

1.4.1Mp、Cp、RSV、ADV、Flu A/B、PIV病原体抗原片的制备

a) 将各项病原体用含有2%胎牛血清的DMEM(细胞维持液)稀释成10-3倍。

b) 将Mp、Cp、RSV菌株分别接种在生长良好的Hep-2单层细胞培养物，ADV接种于A5492单层细胞培养物，FluA/B接种于MDCK单层细胞培养物，PIV接种于LLC-MK2单层细胞培养物中。37℃环境下CO2培养箱吸附1小时，加细胞维持液20 ml，CO2培养箱内继续培养[3]。

c) 待多于25%左右的细胞出现病态表现后收获，用0.25%的胰酶消化细胞，制备细胞悬液并滴加在盖玻片上[4]。37℃ CO2培养箱中继续培养8 h，0.01M PBS浸洗一次，然后在生物安全柜中晾干。

d) 培养至细胞伸展爬片后清洗、-20℃无水乙醇固定过夜。取出后风干为制备好的各病原体抗原片。

1.4.2LP1病原体抗原片的制备

a)将LP1接种于BCYE营养平板上，在-37℃的CO2培养箱内进行培养72 h，待长出单菌落。

b)挑取单菌落，用1 mg/mL BSA的无菌水作为菌体稀释液，重悬菌体OD值至0.6。

c)以20 μl的涂布量涂布盖玻片。

d)把玻片放入丙酮液内，-20℃固定过夜。取出后风干为制备好的嗜肺军团菌抗原片。

1.5质量控制

利用各病原体的质控血清对抗原片进行活性检测。标准如下：每种病原体的3份阴性质控血清均不出现特异性绿色荧光，反应孔上细胞呈红色。最低检出限质控血清应检测到部分细胞呈较弱的绿色荧光；中等阳性质控血清应检测出部分的细胞呈中等强度绿色荧光；检测强阳性质控血清，应有感染细胞出现较强的绿色荧光。

1.6试剂盒的制备

确定FITC的滴定浓度以制备FITC结合物。在每个项目阳性血清确定稀释倍数后，混匀配置后再次检测，确认混合配置阳性对照品合格后确定为试剂盒的阳性对照血清。用10%的新生牛血清将正常人血清进行10倍稀释为本试剂盒的阴性血清。用自制参考品检定中间品和半成品检定后可组装成成品盒，经过质检完成试剂盒的制作。

1.7临床病例血清的检测方法

按照以下方法运用新研发试剂盒对血清进行检测。

a)在发病初期采集患者静脉血2.0 ml-3.0 ml，分离血清，PBS等量稀释。

b)将30 μl稀释后的血清加入150 μl吸附剂中，彻底混匀后移至离心管，离心分离去除沉淀[5]。

c)每个检测孔加样15 μl吸附剂处理过的血清。在一个载玻片的每孔中加入15 μl不稀释的阳性对照，在另一载玻片的每孔中加入15 μl不稀释的阴性对照，使其在37℃湿润环境下反应60 min。

d)纯化水冲洗，PBS洗3次，每次10 min。自然晾干[6]。

e)分别将FITC 15 μl加样在检测孔内，37℃湿润环境下反应30 min。

f)纯化水冲洗，PBS洗3次。自然晾干。

g)在每孔中加入几滴封闭介质，盖玻片封片。

h)在荧光显微镜400倍视野下观察。

使用VIRCELL,S.L公司生产的试剂盒对相同血清样本按照其说明书方法进行检测。

1.8统计学处理计数资料的kappa值和χ2统计学结果均来自SPSS 19.0统计学软件。

2 结果

2.1判定标准

由于FITC在荧光显微镜下呈黄绿色荧光。MP、Flu A/B、PIV、RSV、ADV的IgM在红色细胞的胞膜、胞质和胞核上可见黄绿色荧光。CP和LP1的IgM在黑色背景下可见典型的杆状、球杆状和球状黄绿色荧光。空白对照细胞呈现红色，无其他颜色荧光。8种病毒IgM在每个视野下阳性细胞应达到1%-15%可判断为阳性。使用新研发试剂盒阳性和阴性结果图谱如图1。

图1 新研发试剂盒8种病原体检测结果图谱

注：MP，CP,FluA,FluB,PIV,RSV,ADV,LP分别为8种病原体的阳性检测结果；NEG为相应病原体的阴性检测结果；Control为空白对照。

2.2MP的检测结果

使用新研发试剂盒对MP-IgM的测试结果与VIRCELL,S.L公司试剂盒检测结果具有高度一致性，Kappa值为0.958。如表1。

2.3CP的检测结果

使用新研发试剂盒对CP-IgM的测试结果与VIRCELL,S.L公司试剂盒检测结果具有高度一致性，Kappa值为0.960。如表2。

2.4FluA的检测结果

使用新研发试剂盒对Flu A-IgM的测试结果与VIRCELL,S.L公司试剂盒检测结果具有高度一致性，Kappa值为0.964。如表3。

表1 新研发试剂盒与Vircell检测试剂盒对MP的检测结果对比

注：χ2值为0.36，P>0.05。

表2 新研发试剂盒与Vircell检测试剂盒对CP的检测结果对比

注：χ2值为2.5，P>0.05。

表3 新研发试剂盒与Vircell检测试剂盒对Flu A的检测结果对比

注：χ2值为0.13，P>0.05。

2.5FluB的检测结果

使用新研发试剂盒对Flu B-IgM的测试结果与VIRCELL,S.L公司试剂盒检测结果具有高度一致性，Kappa值为0.945。如表4。

表4 新研发试剂盒与Vircell检测试剂盒对Flu B的检测结果对比

注：χ2值为0.07，P>0.05。

2.6PIV的检测结果

使用新研发试剂盒对PIV-IgM的测试结果与VIRCELL,S.L公司试剂盒检测结果具有高度一致性，Kappa值为0.944。如表5。

2.7RSV的检测结果

使用新研发试剂盒对RSV-IgM的测试结果与VIRCELL,S.L公司试剂检测结果具有高度一致性，Kappa值为0.946。如表6。

表5 新研发试剂盒与Vircell检测试剂盒对PIV的检测结果对比

注：χ2值为1.23，P>0.05。

表6 新研发试剂盒与Vircell检测试剂盒对RSV的检测结果对比

注：χ2值为0.07，P>0.05。

2.8ADV的检测结果

使用新研发试剂盒对ADV-gM的测试结果与VIRCELL,S.L公司试剂检测结果具有高度一致性，Kappa值为0.969。如表7。

表7 新研发试剂盒与Vircell检测试剂盒对ADV的检测结果对比

注：χ2值为0.13，P>0.05。

2.9LP1的检测结果

使用新研发试剂盒对LP1-IgM的测试结果与VIRCELL,S.L公司试剂检测结果具有高度一致性，Kappa值为0.961。如表8。

表8 新研发试剂盒与Vircell检测试剂盒对LP1的检测结果对比

注：χ2值为0.5，P>0.05。

2.10新研发试剂盒与VIRCELL,S.L公司试剂盒对8种呼吸道感染病原体检测的符合率

使用新研发试剂盒对8种病原体的测试结果与VIRCELL,S.L公司试剂盒检测结果具有较高的符合性，阳性符合率、阴性符合率和总符合率均在95%以上。如表9。

表9 新研发试剂盒与同类检测试剂盒对9种呼吸道感染病原体的检测符合率

3 讨论

世界卫生组织于2014年5月更新了有关全球疾病状况的评估报告，报告显示，在过去10年中，缺血性心脏病、卒中、下呼吸道感染和慢性阻塞性肺疾病仍然是导致人类死亡的四大主要原因[7]。回溯传染病发展史，呼吸道感染病疫情从未间断过，严重威胁着人类的健康，并造成严重的社会危害。高效快速地在病情早期对病原体进行筛查和诊断，有利于尽早制定治疗方案，缓解病痛，防止疫情扩大，降低社会危害和国家医疗开支。随着国内体外诊断试剂的研发、技术和生产等方面的迅猛发展，国产诊断试剂由于其高速、高效、价格低廉等优势正在逐渐取代进口产品。

制备抗原片，关键在于如何使病原体感染敏感细胞，经实验发现，传代过夜的细胞处于活性最佳状态，最适合病原体的感染。尤其是CP致病性较弱，我们运用病原体感染Hep-2单层细胞并吸附1 h后，以2 600 r/min的转速将病原体-细胞混合体进行离心1 h，再继续培养，感染效果有明显提高，其机制还不十分明确，但推测可能是由于离心力使病原体和细胞被动接触，借助重力加速度把病原体压入细胞[8-9]，对于RSV、ADV、PIV致病性较强，吸附1-2 h后正常培养即可。总结几种病原体感染敏感细胞的结果，我们发现传代次数较少的敏感细胞更利于病原体感染。

在荧光显微镜下观察结果时应在荧光显微镜的荧光稳定后，在1 h内检测完毕。经后期实验检测，时间过长荧光强度将下降或淬灭。不仅如此，该检测法受到主观因素的影响。为此，疑似抗体阳性血清，应做核酸检测，以明确病毒感染的类型诊断[10]。

从上述试验可以看出，运用间接免疫荧光法新研发的试剂盒虽然特异性不如病毒培养法，但是克服了病毒培养法试验周期长、不能同时检测多种病原体的缺点，具有方便、灵敏、特异、高效、且一次可进行多种病原体检测等优势，对试验开展环境和技术要求较低，在检测的灵敏性和特异性方面与进口产品没有统计学意义上的差别，并且医疗成本较低，适合在各级实验室开展，为呼吸道感染性疾病的及时临床诊治提供可靠依据。但在实验室检测中，应重视分析前、分析中和分析后的质量控制，规范操作，注重细节，才能保证检测结果准确可靠。