肺癌细胞血管外游走过程中血管内皮通透性的变化

刘 楠,辛 华,张乐宁,聂海英

(吉林大学中日联谊医院 胸外科,吉林 长春130033)

肺癌血行转移是一个高度选择性的非随机生物学过程，包括肺癌细胞与血管内皮细胞及细胞外基质之间一系列复杂的生物学作用，其中肺癌细胞向血管外游走是肺癌血行转移的重要环节。为此，我们在体外模拟构建了肺癌细胞血行转移中的血管外游走过程，对肺癌细胞的血管外游走途径加以探讨。

1 材料与方法

1.1实验所用细胞

在包被有明胶的细胞培养皿上培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)；3种肺癌细胞分别为：LK-2、A549、RERF-LC-KJ。

1.2血管内皮单细胞层的制备

将3×104个HUVEC加入预先制备胶原凝胶层的细胞培养皿内，培养1周，经Giemsa染色，在光镜(40×)下观察血管内皮单细胞层是否已完全融合生长。同时将细胞培养皿放入到装有正负电极的培养容器内，与电阻测定仪相连，连续记录血管内皮单细胞层的电阻值。

1.3连续记录肺癌细胞血管外游走过程中血管内皮单细胞层的电阻变化

将培养有单层血管内皮细胞的细胞培养皿放入装有正负电极的培养容器内，与电阻测定仪相连，记录血管内皮单细胞层的电阻值；然后分别将1×105个肺癌细胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)加入细胞培养皿内，连续监测血管内皮单细胞层的电阻变化。

1.4数据统计处理

2 结果

2.1血管内皮单细胞层的确认

经Giemsa染色，在光镜(40×)下观察到血管内皮单细胞层已完全融合生长(图1)。同时测定血管内皮单细胞层的电阻值为9.68±2.05 ohm/cm2，与相关研究报道的数值基本一致[1]，可以认为HUVEC已完全融合生长，在胶原凝胶表面制备成血管内皮单细胞层。

图1 完全融合生长的血管内皮单细胞层(Giemsa染色，40×)

2.2肺癌细胞血管外游走过程中血管内皮单细胞层的电阻变化

因为血管内皮单细胞层的电阻可以用来说明血管的通透性[2]，为此我们连续监测了肺癌细胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)游走过程中血管内皮单细胞层的电阻变化。结果证实在血管内皮单细胞层表面加入肺癌细胞后，会急速出现血管内皮单细胞层的电阻下降，数分钟后下降至最底点，然后缓慢上升(图2)。

图2 肺癌细胞血管外游走过程中血管内皮单细胞层的电阻变化

我们发现肺癌细胞LK-2、A549、RERF-LC-KJ均可以穿过血管内皮细胞游走至血管外，同时引起血管内皮单细胞层的电阻下降；与A549、RERF-LC-KJ相比，LK-2游走过程中血管内皮单细胞层的电阻下降幅度更大，差异有统计学意义(P<0.05)，这也证明了LK-2比A549、RERF-LC-KJ具有更强的穿过血管内皮的能力(图3)。

注：*LK-2与A549、RERF-LC-KJ相比 P<0.05(n=6)图3 各种肺癌细胞血管外游走过程中引起的血管内皮单细胞层电阻下降

3 讨论

肺癌血行转移是一个高度选择性的非随机生物学过程，包括肺癌细胞与血管内皮细胞及细胞外基质之间一系列复杂的生物学作用，其中肺癌细胞向血管外游走是肺癌血行转移的重要环节[3]。我们之前的研究成功在体外模拟构建了肺癌细胞血行转移中的血管外游走状态，发现进入血液循环的肺癌细胞在靶器官穿过血管内皮的前提是肺癌细胞与血管内皮细胞的特异性粘附，这也说明肺癌的血行转移具有器官组织特异性；并证实了粘附后的肺癌细胞可以穿过血管内皮游走至血管外。但肺癌细胞是如何穿过血管内皮的目前还不清楚，我们此次研究的目的就是对肺癌细胞的血管外游走途径加以探讨。

最初有学者认为血管内皮细胞对肿瘤细胞的吞噬和释放是肿瘤细胞穿过血管内皮的途径；但近些年的研究越来越不支持这种观点，有文献报道急性肺损伤的状况下肿瘤的肺部转移病灶明显增多，这提示肺组织损伤导致的肺毛细血管通透性增加可能与肿瘤的血行转移过程关系紧密[4]。因为体外测定血管内皮单细胞层的电阻可以用来说明血管的通透性，为此本研究连续监测了肺癌细胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)游走过程中血管内皮单细胞层的电阻变化，结果证实在血管内皮单细胞层表面加入肺癌细胞后，会急速出现血管内皮单细胞层的电阻下降，这种现象证实了肺癌细胞的血管外游走过程与血管通透性增加密切相关。因为血管通透性的增加是由于血管内皮细胞收缩、细胞间隙增大导致，这也就恰恰说明了肺癌细胞是穿过血管内皮细胞间隙进行血管外游走。实验中我们证实肺癌细胞LK-2、A549、RERF-LC-KJ均可以穿过血管内皮细胞游走至血管外，同时引起单层血管内皮细胞的电阻下降；与A549、RERF-LC-KJ相比，LK-2游走过程中单层血管内皮细胞层的电阻下降幅度更大，证明了LK-2比A549、RERF-LC-KJ具有更强的穿过血管内皮间隙的能力。

我们的研究能够初步揭示肺癌细胞血管外游走过程中与血管内皮细胞的相互作用机制，并为以后的研究打下基础。