山莨菪碱对电离辐射损伤防护作用的实验研究

金大玉 印有亮

1 辽宁省辽阳市中心医院耳鼻喉科(辽阳 111000)

由于头部肿瘤的放疗可导致耳蜗受损，甚至使部分患者放疗后听力丧失，因此，积极寻找能够减轻耳蜗辐射损伤的药物是一项重要的课题。山莨菪碱作为毒蕈碱型(M型)乙酰胆碱受体竞争性阻断剂应用于临床，可通过多途经调节微循环和发挥细胞保护作用，但是山莨菪碱在治疗内耳疾病方面的研究不多，仅有一些关于噪声性聋[1、2]、梅尼埃病和突发性聋等疾病的临床应用报道，对耳蜗辐射损伤的保护作用尚未见文献报道。本文旨在通过观察豚鼠耳颞部放射后耳蜗毛细胞的形态和功能变化，及耳蜗放射前应用及山莨菪碱对耳蜗放射损伤的保护作用，初步探讨其机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 采用耳廓反应灵敏的雄性黑目杂色健康豚鼠25只，体重300～400克，随机分成3组：①正常对照组：5只，不进行照射，观察双耳共10耳；②单纯放射组(单放组)：10只，观察左耳共10耳；③山莨菪碱防护组(防护组)：10只，观察左耳共10耳。

1.2实验方法

1.2.1电离辐射方法 单放组和防护组豚鼠不麻醉，用热塑面膜固定，专用x线模拟定位机定位；暴露头部，用医用直线加速器所产生的6 MeV电子线进行分次照射，每次2 Gy,每周5次，共30次，累计剂量60 Gy。在每次照射前30分钟，对防护组的豚鼠按20 mg/kg股部肌肉注射山莨菪碱，对照组和单放组注射等量生理盐水。

1.2.2听性脑干反应(ABR)阈值检测 各组豚鼠分别于放射前及放射完成后第二天进行ABR阈值检测，以刚能分辨出ABR波Ⅲ的刺激强度确定阈值，并至少重复2次，取平均值作为阈值。

1.2.3耳蜗基底膜铺片及外毛细胞记数 各组随机选择6耳，应用改良全耳蜗基底膜硬铺片技术[3]及四唑氮蓝(nitrotetrazolium blue tetrazolium，NBT)染色，在解剖显微镜下，将基底膜分离出来并置于载玻片上，在400倍光学显微镜下观察毛细胞的形态学变化，并对每个标本连续框取20个视野，逐一进行外毛细胞计数，取其平均值作为每一个标本的外毛细胞计数值。

1.2.4统计学方法 所有计量资料均通过SPSS12.0for windows统计分析软件对数据进行统计学处理，各组照射前后ABR阈值比较采用配对t检验，各组间外毛细胞计数比较采用方差分析中的SNK-q检验。P<0.05代表具有显著性差异。

2 结果

2.1一般状况观察 在放射中及放射后各组豚鼠均无头部偏斜及行走时倾倒趋势，饮食可，无明显消瘦，无死亡。

2.2各组豚鼠实验前后平均ABR阈值

表1 各组豚鼠实验前后平均ABR阈值比较(dB peSPL，±s)(n=10耳)

注：★与同组放射前比较，P<0.05；■放射后单放组与正常对照组比较P<0.05；▲放射后防护组与单放组比较，P<0.05

由表1可见，与放射前相比，放射后单放组和防护组平均ABR阈值增加，差异有统计学意义(P<0.05)，说明放射可引起豚鼠听功能损害；放射后单放组的ABR平均阈值较防护组增高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明山莨菪碱对放射所致的耳蜗听功能损伤有一定程度的保护作用。

2.3耳蜗基底膜铺片高倍镜观察 正常对照组内外毛细胞排列均整齐(图1)。单放组照射耳耳蜗的外毛细胞境界模糊不清，排列非常紊乱，外毛细胞有大量缺失；内毛细胞的排列略紊乱，有少许缺失(图2)。防护组照射耳耳蜗的外毛细胞境界较清晰，排列略紊乱，外毛细胞有少许缺失；内毛细胞排列整齐，缺失不明显(图3)。

2.4耳蜗基底膜铺片外毛细胞计数结果 对照组、单放组及防护组外毛细胞计数分别为：162.95±5.969、54.75±7.718、144.50±7.302个/视野，可见，放射后放射组和防护组外毛细胞计数均较对照组减少(P<0.05),但防护组外毛细胞计数较放射组多(P<0.05)。

图1 正常对照组耳蜗基底膜铺片(×400倍) 内外毛细胞排列均整齐图2 单放组耳蜗基底膜铺片(×400倍) 外毛细胞境界模糊不清,排列非常紊乱,有大量缺如图3 防护组耳蜗基底膜铺片(×400倍) 内毛细胞的排列略紊乱,有少许缺如

3 讨论

山莨菪碱作为M型乙酰胆碱受体竞争性阻断剂应用于临床，其作用机制主要为：①通过各种途径调节微循环；②通过抑制细胞内游离钙升高避免钙超载发生[3，4]和抗氧化作用[5]减少自由基引发的脂质过氧化反应，而实现保护细胞作用。

在本研究中，单放组放射后ABR平均阈值为52.27±2.42 dB peSPL；防护组放射结束后为37.65±1.92 dB peSPL，放射后单放组的ABR平均阈值较防护组增高，表明山莨菪碱对放射所致的耳蜗听功能损伤具有一定程度的保护作用。光镜观察，单放组耳蜗的外毛细胞境界模糊不清，排列非常紊乱，外毛细胞有大量缺失，内毛细胞的排列略紊乱，有少许缺失；防护组耳蜗的外毛细胞境界较清晰，排列略紊乱，外毛细胞有少许缺失；内毛细胞排列整齐，缺失不明显；放射后，单纯放疗组的耳蜗基底膜铺片外毛细胞计数平均值较防护组明显减少，说明山莨菪碱对耳蜗毛细胞有一定程度的保护作用，与ABR阈值检测结果一致。

山莨菪碱对耳蜗辐射损伤防护作用的机制可能与其通过多种途径调节内耳微循环和其细胞保护作用有关。对山莨菪碱抗氧化机理研究发现，它对次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的超氧阴离子自由基有显著的剂量依赖性清除作用[6]，因此，可通过抗氧化作用减少自由基引发的脂质过氧化反应，从而发挥保护内耳毛细胞的作用。本实验仅初步探讨了山莨菪碱对豚鼠耳蜗辐射损伤的保护作用，但关于山莨菪碱的不同剂量与其耳蜗辐射损伤保护作用的关系等有望在以后的研究中进一步完善。