不同来源蛹虫草核苷类成分分析*

李建平，张 铁，曾文波**，马小双

（1．文山学院环境与资源学院，云南 文山 663099；2．文山学院文山州生物资源开发研究中心，云南 文山 663099）

蛹虫草Cordyceps militaris(Fr.)Link.，又称作北冬虫夏草，隶属于艳虫草科（Cordycipitaceae） 虫草菌属（Cordyceps），蛹虫草是其无性型蛹草拟青霉感染鳞翅目昆虫蛹形成的虫菌复合体[1-2]，野生蛹虫草分布广[3]，但是产量较低，无法满足市场的需求。目前，蛹虫草已经实现产业化、规模化培养[4]，价格低至100元·kg-1。由于蛹虫草与冬虫夏草含有相似的化学成分[5]，常被用作冬虫夏草的代用品。

蛹虫草具有补肾，恢复肝功能，调节人体免疫系统，抗肿瘤，抗氧化和调节心血管功能等多种药理功效[6-11]，蛹虫草等虫草真菌含有水溶性核苷类成分、多糖、虫草酸和总黄酮等多种活性成分[12-13]，其中核苷类成分主要包括尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷、腺苷、2’-脱氧腺苷、2’-脱氧尿苷和虫草素等[14]，腺苷具有减少心律，影响心肌收缩力，松弛血管平滑肌，抑制脂肪分解，减少肾血流量和肾素释放，减少儿茶酚胺释放，抑制中枢神经系统，增加cAMP等多种药理功效[15]。虫草素（cordycepin），即 3’-脱氧腺苷 （3’-deoxyadenosine），是1种核苷类似物，与腺苷结构相比，缺少3’-OH，但能参与如基因表达、嘌呤合成等生化反应，也能影响细胞周期、血小板凝集、炎症反应、肿瘤转移等生理、病理进程。研究表明，虫草素具有抗病原微生物、免疫调节、抗肿瘤等药理功效[16]，此外，虫草素在对抗代谢紊乱、氧化损伤、治疗神经系统疾病等方面也具有较好的疗效[17]。肌苷是1种次黄嘌呤核苷制剂，能透过细胞膜进入到细胞内，可提高多种酶的活性，参与能量代谢和蛋白质合成。临床上常用来治疗缺血性心脏病，具有抗心律失常的功效[18]。

人工培养的蛹虫草于2009年被批准为“新资源食品”（后更名为“新食品原料”），是目前唯一可作为食品的虫草类真菌（Cordyceps-like fungi）[19]。蛹虫草现已成为十分常见的药食两用真菌之一，分为鲜品和干品，市面上售卖的主要是蛹虫草的干品，在超市和农贸市场一般都能购买到。经调查发现，蛹虫草产地众多，多数产品未标出其有效成分，没有统一的生产标准和产品质量标准，亟待开展蛹虫草相关标准研究。

本文收集了产自辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古、陕西、广东、福建、云南、西藏、安徽、广西、湖北、江西等不同地区共计30个批次的蛹虫草样品，采用超高效液相色谱法（UHPLC）测定了其中的尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脱氧腺苷、虫草素9种核苷类成分，使用SPSS软件对核苷类成分含量数据进行描述性分析和聚类分析，另外，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），计算了30个蛹虫草样品核苷类成分相似度，为评价不同来源蛹虫草质量提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

购买产地明确的蛹虫草材料，样品来源、生产企业和商家详见表1。分别称取30 g左右蛹虫草，60℃烘干2 h，打粉过80目筛，备用。

表1 蛹虫草样品来源Tab.1 The sources of Cordyceps militaris

尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脱氧腺苷等标准品购自生工生物工程（上海）股份有限公司，纯度为98%以上；虫草素购自上海诗丹德生物技术有限公司，纯度为98%；甲醇，色谱纯，Merck KGaA Darmstadt,Germany；娃哈哈纯净水。其余试剂为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

热电ULTIMATE 3000超高效液相色谱仪（LPG-3400SDN四元梯度泵，WPS-3000SL自动进样器，VWD-3100可变波长检测器，TCC-3000RS柱温箱，Syncronis C18，1.7 μm，4.6 mm×150 mm 色谱柱，“变色龙”控制分析色谱工作站软件），赛默飞世尔科技（中国） 有限公司；SK5200超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；50 g手提式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司；低速离心机（4 000 r·min-1），上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

流动相为甲醇-水（12:88）；等度洗脱，流速0.4 mL·min-1；检测波长260 nm；柱温35℃。在该色谱条件下，尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脱氧腺苷和虫草素等成分色谱峰均能较好地分离，见图1。

1.3.2 对照品溶液的配制

图1 蛹虫草核苷类成分UHPLC图谱Fig.1 UHPLC chromatograms of nucleosides in Cordyceps militaris

分别称取干燥至恒重的尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脱氧腺苷和虫草素对照品各2 mg～5 mg，使用20%甲醇溶解并定容至50 mL。

1.3.3 标准曲线的绘制

分别吸取对照品溶液 1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL、8.0 μL、10.0 μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积，以标准品进样量（换算成标准品重量） 为纵坐标（y），峰面积为横坐标（x），求回归方程，详见表2。

1.3.4 蛹虫草供试液的制备

参考李建平和曾文波[20]的样品处理方法，制备蛹虫草样品供试液。精密称取0.150 g左右蛹虫草样品于15 mL离心管中，加入20%甲醇溶液3 mL，盖紧，混匀，超声处理60 min，放至室温，4 000 r·min－1离心15 min，将上清液转至10 mL容量瓶中，按照上述方法再处理2次，合并上清液，定容至10 mL得样品溶液，使用一次性注射器吸取样品溶液，用0．22 μm微孔滤膜滤过，即得供试液。

表2 核苷类成分的回归方程Tab.2 Regression equation of 9 nucleoside components

1．3．5 核苷类成分含量测定

将处理好的样品供试液，按照上述色谱条件，进样检测，进样量为3 μL，每个样品平行测定3次，根据标准曲线回归方程计算样品中的核苷类成分含量，取平均值。

1．3．6 数据分析方法

采用SPSS 19．0分析蛹虫草核苷类成分含量的基本统计量，包括最大值、最小值、平均值、标准差、变异系数等，并采用聚类分析对30个不同来源的蛹虫草样品核苷类成分含量进行分析。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），评价30个蛹虫草样品指纹图谱相似性。

2 结果与分析

2.1 精密度试验

精密吸取对照品溶液3 μL，按上述色谱条件连续测定5次，获得各成分峰面积，分别计算相对标准偏差。RSD 在 0．07%～0．45%。

2.2 稳定性试验

精密吸取对照品溶液3 μL，按上述色谱条件分别于2 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h测定各成分峰面积，计算相对标准偏差，RSD在0．15%～2．25%，对照品在48 h内稳定。

2.3 重复性试验

分别称取样品（Cmi1） 0．1500 g共5份，按照1．3．4提及的方法处理得到的供试液，分别吸取样品供试液各3 μL，按上述色谱条件测定核苷类成分的峰面积，根据标准曲线将峰面积换算成对照品重量，计算出样品中各成分含量，并计算相对标准偏差，RSD 在 0．98%～3．42%。

2.4 加样回收率试验

精密称取核苷类成分含量已知的蛹虫草样品0．1500 g共3份，分别置于15 mL离心管中，按照上述方法，使用对照品溶液作为提取溶剂，处理得到的供试液，按上述色谱条件测定供试液中核苷类成分含量，计算尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’－脱氧腺苷和虫草素的平均回收率 （n=3），回收率平均值在 96．93%～103．57%，RSD在 3．19%～5．83%。

2.5 核苷类成分含量

采用UHPLC法测定样品中尿嘧啶、尿苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷和虫草素等成分的含量，详见表3。

从表3可以看出，30个蛹虫草样品中，9种核苷类成分含量最高的是产自陕西西安市的Cmi16样品（10 294．16 μg·g－1），最低的是产自广东阳江市的Cmi20样品（4 488．36 μg·g－1），平均值为8 115．06 μg·g－1，变异系数为 15．33%，表明不同来源蛹虫草（组间）核苷类成分总含量差异较小。

2.6 描述统计量

将表3数据输入到SPSS软件中，计算9种核苷类成分含量的最小值、最大值、极差、平均值、标准差及变异系数（CV值），详见表4。

由表4可知，蛹虫草中尿嘧啶含量最小值为6．20 μg·g－1， 最 大 值 为 158．85 μg·g－1， CV 值 为72．03%；尿苷含量最小值为 578．30 μg·g－1，最大值为 2 848．38 μg·g－1，CV 值为 25．69%；肌苷含量最小值为 17．41 μg·g－1，最大值 274．09 μg·g－1，CV 值为50．03%；鸟苷含量最小值为 1 169．53 μg·g－1，最大值 3 513．22 μg·g－1，CV 值为 28．72%；腺嘌呤含量最小值为 14．56 μg·g－1，最大值 116．35 μg·g－1，CV 值为44．29%；胸苷含量最小值为0（未检出），最大值62．40 μg·g－1，CV 值为 57．91%；腺苷含量的最小值为 1 304．05 μg·g－1，最大值 2 893．37 μg·g－1，CV 值为 16．28%；2’－脱氧腺苷含量最小值为 5．60 μg·g－1，最大值 49．02 μg·g－1，CV 值为 35．76%；虫草素含量最小值为 821．67 μg·g－1，最大值 3 555．27 μg·g－1，CV 值为 39．51%。

结果表明，蛹虫草中9种核苷类成分含量高低依次为腺苷、鸟苷、尿苷、虫草素、肌苷、腺嘌呤、尿嘧啶、2’－脱氧腺苷、胸苷，其中，腺苷、鸟苷、尿苷和虫草素是蛹虫草中主要的核苷类成分，占到9种核苷类成分的96．03%；9种核苷类成分变异系数（CV值） 在16．28%～72．03%，由低到高依次为腺苷、尿苷、鸟苷、2’－脱氧腺苷、虫草素、腺嘌呤、肌苷、胸苷、尿嘧啶，这表明腺苷是9种核苷类成分中含量最高、最为稳定的1个成分，虫草素是4种主要核苷类成分中变异最大的成分。此外，各个核苷类成分的CV值均高于核苷类成分总含量的CV值（15．33%），表明不同来源蛹虫草核苷类成分总含量差异较小，但具体到各个核苷类成分则有较大的差异，这可能与其菌种和培养条件有关。

表3 不同来源蛹虫草核苷类成分含量Tab.3 Content of nucleosides in Cordyceps militaris from different sources

表4 不同来源蛹虫草核苷类成分含量分析结果Tab.4 The analysis on nucleosides in Cordyceps militaris from different sources

2.7 聚类分析

将表3数据输入到SPSS软件中，选择菜单中“分析—分类—系统聚类”，选择9种核苷类成分作为变量，样品编号作为标注个案，统计量选择合并进程表、相似性矩阵，绘制选择水平树状图，以聚类方法为组间联接，区间选择Pearson相关性，其他参数为默认值，绘制30个蛹虫草样品聚类树状图，见图2。

图2 不同来源蛹虫草核苷类成分聚类图Fig．2 Dendrogram of cluster analysis of nucleosides in Cordyceps militaris from different sources

由图2可知，样品Cmi1、Cmi2、Cmi3、Cmi4、Cmi5、Cmi6、Cmi9组成了分枝 A，其中，除了Cmi9产自吉林长春以外，其余6个样品均产自辽宁沈阳；分枝B由产自吉林延吉（Cmi7、Cmi8）、黑龙江 （Cmi10）、内蒙古 （Cmi11、Cmi12、Cmi13、Cmi14、 Cmi15）、 广 东 （Cmi18）、 福 建 泉 州（Cmi21、Cmi22）、西藏 （Cmi25、Cmi26）、安徽（Cmi27）、广西（Cmi28） 江西（Cmi30） 15个样品构成；分枝C由产自陕西（Cmi16）、云南（Cmi23）和湖北（Cmi29）的样品构成；分枝F包括产自广东（Cmi17、 Cmi20）、云南临 沧 （Cmi24）、 广 西（Cmi28） 4个样品；分枝 H由产自广东韶关（Cmi19） 的样品构成。分枝A与分枝B构成分枝D，依次与分枝C、分枝F相联构成分枝G，最后与分枝H相联形成树形聚类图。中国的分区图见图3。

图3 中国分区图Fig．3 Geographical zoning map of China

根据中国的分区图，分枝A代表了以沈阳为主的东北来源的蛹虫草；分枝B和分枝C中的样品包括东北（3个）、华北（5个）、华东（4个） 华南（2个）、西南（3个）、西北（1个）15个样品，代表了由北至南过渡地带的样品；分枝F和分枝H全部由西南（1个）和华南（4个）的南方样品构成，代表了南方产地的蛹虫草样品，由图2可知，根据蛹虫草中9种核苷类成分含量生成的聚类图，能较好地反映其样品的来源，即蛹虫草中核苷类成分的含量具有一定的地理相关性。

2.8 指纹图谱相似度分析

使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）评价30个蛹虫草样品指纹图谱相似性。该软件的使用包括图谱导入、设置参照图谱（以平均数法作为对照指纹图谱的生成方法，设定时间窗宽度为0．3 min）、保留时间多点校正、谱峰自动匹配、生成对照图谱和相似度计算等几个主要步骤。根据峰匹配结果，选取峰图时间段为0～35 min，计算样品指纹图谱与对照指纹图谱的整体相似度。不同来源蛹虫草间相似度及其与对照指纹图谱相似度见表5。

由表 5 可知，样品间相似度在 0．69～0．99，两两比较相似度在0．90以上的比例为79．77%（347/435×100%=79．77%），30个样品与对照指纹图谱的相似度在0．84～0．99，结果显示不同来源蛹虫草核苷类成分相似度较高，但仍然存在一定差异。

3 讨论

本文测定了30个不同来源的蛹虫草样品中的9种核苷类成分，并比较了其指纹图谱的相似性，表明不同来源蛹虫草核苷类成分种类及其总量差异较小，样品间核苷类成分整体相似度较高，但仍然存在一定的差异，这可能是受菌种来源不同[21]，不同产地培养条件的差异，如培养基成分、培养时间、温度、湿度、光照等多种因素的影响[22]。蛹虫草已经被批准为新食品原料，可应用到食品、保健食品和药品等多个行业，因此应从筛选优良菌株、优化培养条件等方面着手，制定蛹虫草行业标准，规范蛹虫草栽培和应用，进一步提高蛹虫草中有效成分含量及其质量的稳定性。

表5 不同来源蛹虫草核苷类成分指纹图谱相似度Tab.5 Results of similarity analysis of nucleosides in Cordyceps militaris from different sources

腺苷、鸟苷、尿苷和虫草素是蛹虫草中主要的核苷类成分，其中，腺苷的变异系数最小，表明腺苷成分较为稳定，可作为蛹虫草质量控制的主要指标之一；虫草素具有多种药理功效，是蛹虫草中重要的活性成分，也应作为1项重要的质量控制指标，但其变异系数较大，含量不稳定，这也可能是由不同厂家的菌种来源、培养条件、加工等方面的差异造成的。因此急需制定统一可靠的评价标准，确定人工蛹虫草的质量等级，保障人工蛹虫草的质量可控。