利用均匀设计法优化天麻萌发菌小菇属真菌（Mycena sp.）培养基的研究*

王玉川 ，秦丽媛 ，何海艳 ，陈 林 ，3，4，杨明挚 ，张汉波 ，4**

（1．昭通市天麻研究院，云南 昭通 657000；2．云南大学生命科学院，云南 昆明 650091；3．云南大学生态与环境科学学院，云南 昆明 650091；4．省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650091）

天麻（Gastrodia eleta） 是兰科天麻属（Gastrodia）多年生草本植物，是名贵中药材之一[1]。其种子无胚乳，必须依靠侵染的紫萁小菇（Mycena osmundicales）等真菌才能萌发，种子萌发后又需要侵染的蜜环菌来提供营养才能长大[2-4]。自1989年徐锦堂和郭顺星首次报道天麻种子的萌发菌为紫萁小菇（M.osmundicales） 以来[5]，陆续有一些新的萌发菌报道，如兰小菇Mycena orchidicola、石斛小菇Mycena dendrobii、开唇兰小菇Mycena anoectochili[6]。尽管Liu等（2010） 表明来自其他4个属Chaetomium、Epulorhiza、Cephalosporium、Ceratorhiza的真菌也可以促进天麻萌发[7]。相对来说，小姑属真菌仍然是目前最为有效和广泛地用于人工栽培天麻的萌发真菌类群[8-9]。

萌发菌小菇属真菌为弱腐生菌，培养条件苛刻[10]，培养过程中存在着生长时间过长，生物量偏低的问题。目前各天麻产区对菌种的需求量日益扩大。天麻萌发菌一级、二级种的质量会影响三级种的质量，而三级种的质量直接影响天麻的产量和品质。因此，了解小菇属真菌的培养基营养因子需求并进行培养基优化研究，探讨小菇属真菌营养因子间的相互作用关系，对于解决这一现实问题具有重要意义[9]。均匀设计是王元和方开泰于1978年提出的[11-12]，该方法最大的特点是试验点在试验范围内均匀散布，较之其他试验设计方法如正交试验设计等，可以很大程度地减少试验次数，以较少的试验点获得最多的试验信息[13]。本试验运用均匀设计法对小菇属真菌培养基进行优化并研究某些营养因子间的相互作用，旨在了解小菇属真菌对营养因子的需求规律，为缩短小菇属真菌的一级种培养时间，高效获取优质接种菌剂奠定一定基础。

1 试验材料和方法

1.1 试验菌株

天麻萌发菌菌株BZZ由昭通市天麻研究院根据徐锦堂和冉砚珠的方法[14-15]，从天麻原球茎分离、纯化得到。经过ITS基因序列测定，该菌株与小菇属真菌（Mycenasp.）具有最近的亲缘关系，但目前尚未鉴定到种。

1.2 试验方法

1.2.1 优化营养因子的确定

查阅文献选取14个影响真菌生长的因素来优化小菇属真菌培养基，分别为：葡萄糖（X1）、α-乳糖（X2）、蔗糖（X3）、可溶性淀粉（X4）、蛋白胨（X5）、酵母膏（X6）、NH4Cl（X7）、(NH4)2SO4（X8）、甘露醇（X9）、甘氨酸（X10）、烟酸（X11）、维生素（X12）、KH2PO4（X13）、MgSO4·7H2O（X14），根据文献确定这些因素使用的浓度梯度均为5个，具体见表1。基于前期研究结果，天麻种子萌发菌的最佳生长温度为25℃，适宜生长的pH值范围为5.0～6.0[5]，因此本试验固定了培养基pH值为5.5，培养温度为25℃。

1.2.2 菌株培养

配制双抗PDA培养基30皿，并在无菌操作下将灭好菌的玻璃纸贴于培养基，将菌种接于培养基中心，待菌丝长满，备用。按照均匀设计法确定的配方配制培养基，每个配方培养基配制100 mL，制备5个培养皿，采用无菌操作，将灭好菌的玻璃纸贴于培养基。将长满PDA培养皿的菌丝用6 mm无菌打孔器打上菌片（图1）。在每个培养皿圆心处接种1个菌片，封好封口膜，倒置培养于25℃恒温培养箱。

图1 菌丝打孔图Fig.1 Mycelial dishes for inoculation

1.2.3 数据测量

接上菌片后，每天观察并测量菌落直径。待试验结束时，将每种培养基上的菌落刮下测量其鲜重。

1.3 配方优化和验证

根据测量得到的菌落直径和生物量数据进行二次多项式逐步回归，得到这两个指标关于各因素的方程。用此方程计算优化配方，并进行试验验证。为了进一步了解优化配方中重要因子的相互作用，用三维等高线图研究两因子间相互作用，其他因子用优化配方中的值固定。

1.4 数据处理

均匀设计法采用DPS 7.5软件，二次多项式逐步回归，三维等高线图用MATLAB 2010b软件进行计算和绘制[16]。其他数据用IBM SPSS statistics和Excel软件进行处理。

2 试验结果

2.1 培养基的均匀设计

利用DPS7．5软件进行均匀设计，形成30个组合配方，该组配方的参数分别为中心化偏差CD=0．994，L2－偏差 D=0．0009，修正偏差 MD=3．2794，对称化偏差 SD=23．7993，可卷偏差 WD=3．7742，条件数 C=2．0635，D－优良性=0，A－优良性=0．0172，由参数可知该配方均匀性较好可用于后续试验。按照均匀设计的配方配制培养基后培养菌株并测量、记录菌落直径和生物量（表1）。

随着时间的推移菌落不断生长，至第18天菌落直径较大的配方为N8、N12、N25、N28、N29；生物量较重的配方为N8、N12、N29，其中直径最大且生物量最重的为N12配方组合。单因素方差分析结果表明，在整体水平上组间达到极显著差异（P＜0．01）。

利用DPS7．5和MATALB软件，根据表1各配方的菌落直径和生物量分别进行二次多项式逐步回归，得到相应方程（1） 和方程（2）。

其中，Y1代表菌落直径，Y2代表生物量，X1～X14分别为影响萌发菌生长的因子（表1）。方程（1）相关系数 R=0．9954，F 值=133．5997，P=0．0001，剩余标准差 S=2．5 554，Durbin－Watson 统计量 d=2．1255；方程（2） 相关系数 R=0．9989，F=283．2258，P=0．0001，剩余标准差 S=0．0097，Durbin－Watson 统计量d=2．0352。说明2个方程能够正确反映各因子对萌发菌生长情况的影响。由方程（1）可以看出选择的14个因素中有12个因素影响菌落直径的大小，烟酸和MgSO4·7H2O在试验范围内对菌落直径影响较小，其中葡萄糖和蔗糖、乳糖和蛋白胨、乳糖和磷酸二氢钾等8组因素有一定交互作用。由方程（2）可以看出选择的14个因素有13个因素影响生物量大小，维生素B1在试验范围内对生物量影响不大，其中乳糖和氯化铵、乳糖和磷酸二氢钾、蔗糖和可溶性淀粉等13组因素有一定交互作用。

2.2 培养基配方优化结果

以均匀设计中菌落直径、生物量为优化对象，约束条件根据表1中最好的N12配方的结果，确定为菌落直径≥64．7 mm、生物量≥0．5092 g，且考虑各因素实际使用范围，以0．1个单位为求解步长，采用穷举法[17]将参数设置范围内的数值以矩阵方式代入模型计算，通过联立优化，进一步确定较优培养基配方，结果见表2。

优化配方为可溶性淀粉 4 g·L－1、蛋白胨 4 g·L－1、酵母膏 4 g·L－1、甘露醇 8 mg·L－1、烟酸 4 mg·L－1、KH2PO41．6 g·L－1、MgSO4·7H21．6 g·L－1。以 N12 配方作为验证此优化配方的对照配方，重新培养菌株，得到菌落直径和生物量，见表2。

由表2可以看出，以菌落直径和生物量同时作为指标的优化组合达到了较好的优化效果，随着时间的推移，从第9天到第21天菌落直径均在增长，且优化组合的增速大于N12配方。测量第21天时优化组合配方与未优化配方（N12）相比，菌落直径和生物量分别提高了48%和59%，差异极其显著（P＜0．01）。

2.3 优化培养基条件下营养因素相互作用探讨

为进一步探讨在优化培养基条件下各个因素对小菇属真菌菌落直径和生物量的影响，将优化培养基各个因素的用量带入方程（1） 和方程（2），计算得到二者的优化方程（3）和方程（4）。结果表明，可溶性淀粉（X4）和KH2PO4（X13）的交互作用，蛋白胨（X5）和酵母膏（X6）的交互作用对菌落直径有显著影响（优化方程（3））；除甘露醇（X9）平方项和MgSO4·7H2O（X14）平方项对生物量有影响外，蛋白胨（X5）和MgSO4·7H2O（X14）的交互作用，甘露醇（X9）和MgSO4·7H2O（X14）的交互作用同样也对生物量有显著影响（优化方程（4））。因此，通过Matlab 2010b三维等高线图和曲线图，进一步研究这些平方项和交互项对小菇属真菌菌落直径和生物量的影响。

方程（1） 简化为：

研究X4和X13对菌落直径的影响时，固定其他因素用量为优化培养基用量，即X5=4，X6=4，代入方程 （3），计算得到 Y=0．215*X13*X4＋52．7，上述方程绘制三维等高线图（图2A）。由图2A可知，可溶性淀粉和磷酸二氢钾共同对小菇属真菌菌落直径影响为正，随着二者浓度增大小菇属真菌菌落直径增大；当二者用量较大时，协同促进菌落直径快速增大；研究X5和X6对菌落直径的影响时，固定其他因素用量为优化培养基用量，即X4=4，X13=1．6，代入方程 （3），计算得到 Y=0．0276*X5*X6＋ 55．0，将上述方程绘制三维等高线图（图2B）。由图2B可知，蛋白质和酵母膏共同对小菇属真菌菌落直径影响为正，随着二者浓度增大小菇属真菌菌落直径增大；当二者用量较大时，协同促进菌落直径快速增大。

表1 合成培养基均匀设计配方Tab.1 Uniform design formula of synthetic media

表2 优化配方的菌落直径和生物量Tab．2 Mycena colony diameter and biomass obtained by optimized formula

图2 部分营养因子对小菇属真菌直径的交互影响Fig．2 Interactions of some nutrient factors on the colony diameter of Mycena sp．

方程（2） 简化为：

研究X9平方项对菌落生物量的影响时，固定其他因素用量为优化培养基用量，即X5=4，X14=1．6代入方程 （4），计算得到 Y=4．6*10^(－4)*X9^2 ＋6．3*10^(－4)*X9＋ 0．354，将上述方程进行绘图 （图3A）。由图3A可知，随着甘露醇量的增加小菇属真菌生物量增大，且呈现开始增速慢，而后随着浓度增大增速加快的趋势；研究X14平方项对生物量的影响时，固定其他因素用量为优化培养基用量，即，X5=4，X9=8，代入方程 （4），计算得到 Y=－ 3．28*10^(－4)*X14^2 ＋ 0．00457*X14＋ 0．382，将上述方程进行绘图（图3B）。由图3B可知，随着MgSO4·7H2O的增加小菇属真菌生物量增大，且随着浓度的增加增速近乎一致；研究X5和X14对生物量的影响时，固定其他因素用量为优化培养基用量，即X9=8代入方程（4）， 计 算 得 到 Y=0．00315*X14＋3．55*10^(－4)*X14*X5－ 3．28*10^(－4)*X14^2 ＋ 0．382，将上述方程进行三维等高线图绘制（图3C）。由图3C可知，蛋白胨和MgSO4·7H2O协同促进小菇属真菌生物量；研究X9和X14对生物量的影响时，固定X5=4，代入方程（4）计算得到 Y=－ 3．28*10^(－4)*X14^2 ＋ 3．94*10^(－4)*X14*X9＋ 0．00142*X14＋ 4．6*10^(－4)*X9^2 ＋ 0．353，将上述方程绘制三维等高线图（图3D）。由图3D可知，甘露醇和MgSO4·7H2O两因子协同促进生物量的增加，且当两因子用量均较大时，对生物量的协同促进作用较明显。

3 讨论

目前在各天麻产区，生产用菌种的需求量日益扩大[9]。研究影响萌发菌生长的营养因子，无论是对大规模深层液体发酵工艺还是传统固体技术进行制种[18-19]，都具有重要理论和现实意义。然而，目前对萌发菌生长的基本营养要求尚缺乏深入的比较研究。

图3 部分营养因子对小菇属真菌生物量的交互影响Fig.3 Interaction of some nutrient factors on the biomass of Mycena sp.

本试验运用均匀设计法较为系统研究了目前在真菌培养过程中常见营养因子对小菇属真菌的生长影响。结果发现在选择的14个因素中有11个因素影响菌落直径的大小，其中葡萄糖和蔗糖、乳糖和蛋白胨、乳糖和磷酸二氢钾等8组因素有交互作用。以生物量看，选择的14个因素有13个因素影响有效应。其中乳糖和氯化铵、乳糖和磷酸二氢钾、蔗糖和可溶性淀粉等13组因素有交互作用。而可溶性淀粉和KH2PO4的交互作用，蛋白胨和酵母膏的交互作用对菌落直径有显著影响；蛋白胨和MgSO4·7H2O的交互作用，甘露醇和MgSO4·7H2O的交互作用对生物量大小有影响（图2、图3）。这些结果表明影响小姑属真菌生长的营养因子不但多，而且大多数因子都为交互作用。比如，甘露醇和MgSO4·7H2O在用量较大时，对小菇属真菌生物量影响较大，如果调整配方时，稍下调其中1个的使用量，将会使小菇属真菌生物量大幅下降。因此，在调整优化配方时要综合衡量，平衡调整，尽量调整影响小并且与其他因子交互作用较弱的因子。

在验证优化培养基时，N12培养基中测量得到的菌落直径和生物量均相比均匀设计时有所下降，并且优化配方的生物量也较方程计算生物量有所下降（表1、表2）。这可能是由于不同试验批次中采用的接种菌丝活力，培养理化条件等波动造成。但当利用优化配方与配方N12在同一条件下进行培养时，优化培养基较配方N12的小菇属真菌直径和生物量均较大（表2）。因此，可以认为优化的方向是正确的，本优化培养基配方能较好促进小菇属真菌生长。