MTHFR C677T基因多态性对干预Hhcy后脑梗死复发的影响

刘海艳 魏秀娥 荣良群 许 静 杨 华 张翠翠

徐州医科大学第二附属医院神经内科，江苏 徐州 221006

近年来多项研究认为，高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，Hhcy)是缺血性脑血管病新的独立危险因素[1-3]。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)再甲基化途径中的一项重要物质，MTHFR基因突变可导致Hhcy[4]，大量的研究也认为MTHFR基因C667T突变与缺血性脑血管病密切相关[5-10]。然而，对合并Hhcy脑梗死患者进行Hhcy干预是否能降低卒中复发风险目前尚有争议[11-13]，结局是否受MTHFR677TT基因型的影响也不清楚。本研究对伴Hhcy的脑梗死患者给予标准二级预防治疗或标准治疗及干预Hhcy，观察1 a不同MTHFR677位基因型脑梗死患者缺血性卒中复发情况，以期为伴Hhcy脑梗死患者二级预防的个体化治疗方案提供依据。

1 资料与方法

1．1临床资料选择2012-09—2014-09徐州医科大学第二附属医院神经内科Hcy>15 μmol/L的 2个月内新发363例脑梗死患者，脑梗死诊断符合全国第4届脑血管病学术会议修订的诊断标准，排除心源性卒中患者，年龄>20岁。

1．2治疗方法采用前瞻平行对照方法将研究对象分为2组，A组：标准二级预治疗及干预HHcy组180例(叶酸 5 mg/d，维生素B625 mg/d，维生素B120.5 mg/d)；B组：标准二级预防组183例。对入组患者进行MTHFR677位基因检查，分为CC型、CT型、TT型。随访1 a，终点事件为缺血性脑卒中复发。

详细记录性别、年龄、文化程度等人口学资料以及抽烟史、饮酒史、卒中史、高血压史、糖尿病史、冠状动脉粥样硬化性心脏病史、血糖、血脂、肌酐、Hcy水平等血管病危险因素以及MTHFR677位基因型、影像学资料。检测患者入组时、1 a血浆Hcy以及血糖、血脂、肾功能等生化指标；记录患者入组时、干预后1 a神经病学状况及影像学资料，观察脑卒中复发。神经影像评定采用1.5T磁共振常规T1、T2、Flair、DWI成像、MRA。

1．3血样采集Hcy水平测定采用竞争免疫法酶测定Hcy，>15 μmol/L为Hhcy。

1．4 MTHFR基因多态性分析采用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性( PCR-RFLP)技术检测MTHFR基因型。用血液DNA基因试剂盒提取基因组DNA，MTHFR扩增引物序列参考文献，PCR反应体系50 μL常规配制，扩增MTHFR基因的反应条件为：94 ℃变性5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30个周期，72 ℃延伸7 min；取10 μL的PCR产物，Hinf Ⅰ限制性内切酶6 U，加双蒸水至20 μL，37 ℃消化3 h，2%琼脂糖凝胶电泳判断酶切结果。可见MTHFR有3种基因型：TT纯合型，酶切后含有174 bp及72 bp 2种片段；CT杂合型，有246 bp、174 bp和72 bp 3种片段；CC野生型，仅有246 bp片段。见图1(1为Marker，5为CC野生型，4、7为CT杂合型，2、3、6为TT(纯合型)。

2 结果

2．1 3种基因型比较CC型111例，CT型153例，TT型99例，分别占30.58%、42.14%、27.27%。3组间比较，年龄、抽烟、饮酒、糖尿病、血浆胆固醇、LDL、血糖差异无统计学意义(P>0.05)；3组高血压比例、Hcy水平有明显的不同，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步两两比较发现，TT型患者高血压比例、Hcy水平明显较其他两型高，其他两型高血压比例以及Hcy水平无明显差异。

图1 MTHFR基因PCR产物酶切图Figure 1 MTHFR gene PCR product cleavage map

表1 三种不同基因型脑梗死患者基线比较Table 1 Baseline comparison of three different genotypes of patients with cerebral infarction

2．2 3种基因型脑卒中复发情况CC基因型患者中标准治疗+干预Hhcy组56例，1 a卒中复发11例，复发率19.64%；标准治疗组55例，1 a卒中复发12例，复发率21.8%，两种治疗方案间卒中复发率比较差异无统计学意义。CT基因型患者中标准治疗+干预Hhcy组76例，1 a卒中复发14例，复发率18.42%；标准治疗组77例，1 a卒中复发15例，复发率19.5%。两种治疗方案间卒中复发率比较差异无统计学意义。TT基因型患者中标准治疗+干预Hhcy组49例，1 a卒中复发5例，复发率10.20%；标准治疗组50例，1 a卒中复发13例，复发率26%，两种治疗方案间卒中复发率比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2．3 MTHFR677TT患者卒中复发单因素分析MTHFR677TT患者两种不同治疗方案卒中复发率差异明显，单因素分析结果显示，性别、抽烟、饮酒、胆固醇水平、LDL、Hcy水平在2组间无明显差异(P>0.05)；年龄、高血压、糖尿病、干预Hhcy治疗在2组间差异有统计学意义(P<0.05)。

2．4 TT基因型患者缺血性卒中复发的多因素分析为进一步明确TT基因型患者干预Hhcy对缺血性卒中复发的影响，排除各危险因素影响相互关系，将年龄、高血压、糖尿病、干预Hhcy作为自变量，缺血性卒中再发为应变量，进行逐步条件Logistic回归分析，结果发现高血压、糖尿病均是TT型缺血性卒中复发的独立危险因素，而干预Hcy是卒中复发的保护性因素，OR值分别为0.678，95%CI0.424～0.961，P<0.05。见表4。

3 讨论

研究发现，Hhcy增加卒中复发风险[14-15]。MTHFR是Hcy代谢关键酶之一，研究显示MTHFRC677T 突变可导致MTHFR酶活性下降，其中CT型、TT 型人群的酶活性分别为C/C型的65%和30%，因此 TT 型人群可能最易患Hhcy。一项荟萃分析[4]证实 MTHFR 677位TT基因型人群比CC/CT基因型人群有更高的Hcy。LI等人[5]的荟萃分析发现MTHFR677位TT的基因型是缺血性卒中的危险因素，携有TT基因型患者脑卒中的风险增加(OR=I.43，95%CI：1.20～1.70)。 国内学者研究[16]发现卒中复发患者T型基因携带比例较新发中青年卒中患者高，提示TT型基因是脑梗死复发的危险因素，在中青年卒中人群中也有类似结果[17]。但目前伴Hhcy脑梗死患者进行Hhcy干预是否能降低卒中复发风险尚无明确的定论，结果是否受MTHFR677TT基因型的修饰也不清楚。

本研究显示，MTHFR677TT基因型患者Hcy水平明显高于其他两型，CC与CT型患者Hcy水平大致相同，与TT基因型MTHFR酶活性下降70%有关。本研究也显示，TT基因型伴高血压比例更高，符合中国高血压特点。研究发现，中国高血压患者50%以上伴Hhcy[9]，且约24%高血压患者携带MTHFRTT基因型[18]。在1 a随访期中，本研究显示，MTHFR677不同基因型干预Hhcy与未干预Hhcy比较，缺血性脑卒中复发情况不同。CC与CT型患者中，干预Hhcy与不干预Hhcy缺血性脑卒中复发率无明显差异；而在TT型患者中，干预Hhcy后缺血性脑卒中复发率较未干预Hhcy的低。为进一步了解MTHFR677TT型缺血性脑卒中复发可能的影响因素，对卒中复发未复发进行单因素分析，结果显示，年龄、高血压、糖尿病、干预Hhcy 2组间有明显差异；进一步多因素Logistic回归分析显示，干预Hhcy是卒中复发的保护性因素，提示对于MTHFR677TT基因型患者控制Hhcy水平卒中复发风险下降，可能获益更大。HOLMES等[4]的Meta分析显示，在叶酸水平较低亚洲人群中，MTHFR TT基因型增加缺血性脑卒中风险更明显(OR=1.68，95%CI1.44～1.97)，降低Hcy对卒中预防作用会更大(RR=0.78，95%CI0.68～0.90)，提示干预Hhcy对卒中的影响受叶酸水平以及MTHFR TT基因型修饰的影响，与本研究类似。近期我国一项关于MTHFR基因型、叶酸干预Hhcy对卒中一级预防的修饰作用研究发表[19]，结果显示在CC和CT基因型人群中，叶酸干预只有在高浓度Hcy情况下降低缺血性卒中风险(HR0.8，95%CI0.65～0.99)，而在TT基因人群中，叶酸干预在低浓度Hcy情况即可降低卒中风险(HR0.45，95%CI0.24～0.85)，该研究得出在中国人群中Hcy对卒中的风险受MTHFRC677位基因多态性以及补充叶酸修饰作用，也得出与本研究类似的结论。目前尚不清楚MTHFR基因多态性对干预Hhcy的卒中预防作用修饰的原因，考虑可能与TT基因型携带者可给予叶酸以及多种B族维生素后Hcy明显下降有关。本研究非随机对照研究，结论有一定的偏倚，需要进一步大规模的随机对照研究进一步证实。

表2 三种基因型脑卒中不同治疗复发率比较 (n)Table 2 Comparison of recurrence rates of different genotypes of stroke in different treatments (n)

表4 MTHFR677位TT型缺血性卒中复发危险因素的Logistic回归分析Table 4 Logistic regression analysis of risk factors for recurrence of TT ischemic stroke in MTHFR677

本研究显示，MTHFR基因对干预Hhcy脑卒中预防有有修饰作用，TT型基因携带者给予干预Hhcy对卒中复发的影响更明显。MTHFRC677T基因突变率在不同人种中也不同，我国MTHFR677TT基因型约占25%，明显高于欧美国家，提示根据MTHFR677基因型对我国合并Hhcy患者进行个体化治疗指导可能更有意义。