RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术在结核病诊断中的价值分析

柴国祥 韩斌孝 孙建军 章国平 杨永红 王磊 牛晨霞 李兴芳 徐英春

我国是结核病高发的国家之一, 对结核病的防治与治疗是一项长期的研究工作［1］。而近年来, 新耐药结核的出现,结核病的防治又出现了新挑战［2］。因此, 对于结核病的诊断能力加强也是当前结核病控制的一个重点。对结核病的检查中, 细菌学的检查是作为该病诊断的金标准, 传统检查应用的抗酸染色涂片的检查敏感性较低仅为9%~35%, 分枝杆菌的复合群快速培养平均报阳较低, 也难满足临床上对结核病的快速诊断需求［3,4］。因此, 本研究通过采用RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术, 对疑似为结核病的患者痰样本进行检测分析, 结果对比痰菌培养及痰涂片检查结果, 研究取得一定成果, 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院2016年2月~2018年2月收治的疑似肺结核病患者400例作为研究对象, 其中男243例, 女157例；年龄13~78岁, 平均年龄(43.47±11.51)岁；400例疑似肺结核病患者中依据《肺结核和治疗指南》的诊断结果为肺结核的患者183例, 依据患者的临床表现、结合病理学分析、痰涂片与培养等诊断为其他肺部疾病患者217例。

1. 2 方法

1. 2. 1 痰抗酸杆菌涂片与痰分枝杆菌的培养 选择BACTEC MGIT 960快速培养法对患者痰样本采集、分离与预处理, 并对痰分枝杆菌分别进行涂片与培养。

1. 2. 2 样本处理 400例疑似肺结核病患者通过RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术进行检测。RNA实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒(上海仁度生物技术有限公司, 批号：20130407)。痰样本采集、分离与预处理。取得待测标本11400×g高转速离心机下进行离心5 min, 并除去上清液；后加入1 ml的生理盐水进行洗涤, 再次除去上清液；并加入浓度为50 μl的人淋巴毒素β(LTB)稀释液进行重悬,超声处理15 min, 11400×g高转速离心机下重复进行离心5 min, 备用。

1. 2. 3 扩增检测 取2 μl的处理物加入到30 μl的扩增检测液当中。检测前对微量反应管进行恒温预热, 在60℃温度下预热10 min后, 转至42℃温度下进行预热5 min；同时对实时荧光核酸恒温扩增酶液进行预热至温度达到42℃。预热结束后, 对每支反应管单独加入10 μl的实时荧光核酸恒温扩增酶液, 并进行充分混匀, 反应管同时快速转到荧光定量PCR仪(7500 FAST, 美国ABI)当中。荧光定量PCR仪反应程序荧光通道设定FAM, 42℃下、1 min, 进行40个循环；荧光信号收集以1 min 1次。H37Ra菌株为阳性对照, 以无菌水为阴性对照。

1. 3 观察指标及判定标准 以样本的曲线与阈值的曲线产生的交叉点横坐标读数, 即样本检测时间为DT, 当DT≤35 min则检测为阳性；当DT >40 min则检测为阴性；其中中间读数以重新检测, 并记录复测值。

1. 4 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件对数据进行处理。计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 检测结果分析 以临床诊断结果为金标准, RNA实时荧光核酸恒温扩增检测出结核病患者阳性133例, 涂阳患者61例, 涂阴72例, 敏感度为72.68%, 特异度为98.62%。实时荧光核酸恒温扩增检测的符合率为86.75%, 显著高于痰分枝杆菌的培养(69.75%)和痰抗酸杆菌涂片(67.50%), 差异具有统计学的意义(P＜0.05)。其中实时荧光核酸恒温扩增检测的3例非阴性阳性, 涂片均为阳性。见表1。

2. 2 不同肺结核患者的实时荧光核酸恒温扩增检测结果 183例诊断结果为肺结核的患者中, 涂阳培阳患者实时荧光核酸恒温扩增检测检出率为100.00%, 涂阴培阳患者检出率为78.95%, 涂阴培阴患者检出率为56.00%, 涂阳培阴患者检出率为40.00%。见表2。

表1 肺结核检测结果(n)

表2 不同肺结核患者的实时荧光核酸恒温扩增检测结果(n, %)

3 讨论

肺结核作为高发病率的疾病, 其发现率却仅在40%左右。对于结核患者进行快速的诊断是结核防控项目的一个重点, 以往常规检测方法往往很难达到快速诊断的效果［5］。而在近年来, 随着技术的改进, 荧光定量PCR技术逐渐应用到肺结核的检验当中, 该技术能快速、高效的进行诊断。本研究采用RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术, 其检测优点在于能够直接的以结核分枝杆菌的特异性RNA作为扩增的靶标, 并以扩增的产物RNA作为检测的靶标, 因为RNA仅在活菌当中才能存在, 在结核分枝杆菌死亡后, RNA会降解。因此, 该方法可以实现对活动性的肺结核及该病的治疗效果监测。通过400例疑似结核痰样本研究结果显示, 以临床诊断结果为金标准, RNA实时荧光核酸恒温扩增检测出结核病患者阳性133例, 涂阳患者61例, 涂阴72例, 敏感度为72.68%, 特异度为98.62%。实时荧光核酸恒温扩增检测的符合率为86.75%, 显著高于痰分枝杆菌的培养(69.75%)和痰抗酸杆菌涂片(67.50%), 对比差异具有统计学意义(P＜0.05)。其中RNA实时荧光核酸恒温扩增检测的3例非阴性阳性, 涂片均为阳性。183例诊断结果为肺结核的患者中, 涂阳培阳患者RNA实时荧光核酸恒温扩增检测检出率为100.00%, 涂阴培阳患者检出率为78.95%, 涂阴培阴患者检出率为56.00%,涂阳培阴患者检出率为40.00%。研究结果均显示RNA实时荧光核酸恒温扩增检测能有效的对结核病进行检测。

综上所述, RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术对检测肺结核病具快速、便捷、经济和高敏感度等特点, 该方法值得在临床的结核筛查中进行应用。