液体法联合固体法同步培养在生殖道支原体检测中的临床应用

叶丹 刘延一 姚艳兰 吴博

支原体是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁, 形态呈高度多形性, 能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核细胞型微生物［1］。支原体在自然界分布广泛, 目前已分离出200余种, 寄居人体的有16种, 其中与泌尿生殖道感染相关的支原体有解脲支原体(U.urea-lyticum, Uu)、人型支原体(M.hominis, Mh)、生殖支原体(M.genitalium, Mg)。Uu和Mg是引起男性非淋菌性尿道炎的病原体［2］, Mh与产后发热, 盆腔炎和细菌性阴道炎有关［3］。Uu和Mh主要通过体外培养进行检测, 在临床应用比较广泛。生殖支原体营养要求高,在一般支原体培养基不生长。由于培养难度大, 临床主要通过聚合酶链反应(PCR)技术来检测生殖支原体。支原体培养是目前国内医疗机构进行Uu和Mh检测的重要手段, 主要是使用液体培养基直接检测并同时进行支原体药敏试验［4］,以达到尽早为临床治疗用药提供依据的目的。但液体培养法有时候会受到细菌或真菌的污染导致假阳性, 给临床带来误诊。固体培养是经24~48 h小时后用显微镜直接观察培养基上支原体属典型的菌落形态, 是诊断支原体感染的“金标准”。作者对临床收集的202份生殖道标本进行了两种方法同步检测, 旨在发现联合检测的优势。现将检测结果报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2017年3月~2018年1月本院门诊妇科、泌尿外科、皮肤性病科拟诊为泌尿生殖道感染的202例患者, 其中男111例, 女91例；年龄18~73岁。严格按照采样要求对男性采集尿道拭子, 女性采集宫颈分泌物后立即送检。

1. 2 试剂与仪器 Uu和Mh选择分离培养、鉴定、药物敏感性试验试剂盒, Uu和Mh选择分离培养固体培养基(众爱生河北生物科技有限公司), 力康HF240二氧化碳培养箱, 奥林巴斯CX23光学显微镜。

1. 3 方法 严格按照试剂说明书操作完成液体培养和固体培养。24 h后观察Uu、Mh在液体和固体培养基上生长情况和并记录；48 h后再观察, Uu以24 h结果报告, Mh以48 h结果报告。当液体培养变色, 固体培养没有典型菌落生长时, 将液体培养基原液吸取10 μl转种一块新的固体培养基,24~48 h后显微镜下再观察。

1. 4 观察指标及判定标准 观察液体与固体培养基的结果差异, 以及液体阳性、固体阴性的转接结果。液体培养阳性：培养24~48 h培养基有黄色变红, 清亮无混浊。

固体培养阳性：培养24~48 h时, 镜下放大40~100倍,可见Mh菌落较大, 为油煎蛋样；Uu菌落小, 呈圆形棕褐色,且培养基由浅黄色变为浅红色。

1. 5 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 同步培养结果 202份生殖道标本液体培养检出Uu阳性84份, 阳性率41.6%, 检出Mh阳性35份, 阳性率17.3%；固体法培养检出Uu阳性61份, 阳性率为30.2%, 检出Mh阳性20份, 阳性率为9.9%。两种培养法Uu和Mh阳性率差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见表1, 表2。

表1 两种方法对Uu的检出结果(份)

固体培养法 液体培养法合计阳性 阴性阳性 20 0 20阴性 15 167 182合计 35 167 202

2. 2 转种后结果 23份液体培养阳性、固体阴性的再转种固体培养基有5份可见典型Uu菌落, 其中3份男性尿道标本,2份女性宫颈分泌物标本。

3 讨论

支原体是泌尿生殖道感染常见的病原微生物, 与非淋菌性尿道炎、阴道炎, 前列腺炎, 宫颈炎和盆腔炎, 不孕不育等有关［5］, 其中Uu可引起精子畸形、早产、流产、死胎等,准确检测支原体对临床诊断和治疗有十分重要的意义。

目前国内医院普遍开展Uu和Mh的常规检测和药敏试验, 几乎均采用液体培养法［6,7］。液体法检测原理基于Uu和Mh能分解培养液中的尿素和精氨酸产生碱性物质, 使含酚红的培养液pH升高由黄色变成红色, 培养液变红即认为有支原体生长。多篇文献均提到该方法有一定缺陷［8-10］, 这实际上是利用单一生化反应进行鉴定, 但这一生化反应并非支原体所特有, 泌尿生殖道内定植的多种细菌和念珠菌会分解尿素或精氨酸使培养液变红, 造成假阳性。有研究表明［11］,变形杆菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌分解尿素是导致Uu培养假阳性的主要原因。当细菌浓度>103cfu/ml时对支原体培养结果影响较大, 且细菌浓度越高越容易影响支原体药物敏感性判断的准确性, 而细菌浓度<103cfu/ml对支原体培养结果无影响。念珠菌中克柔念珠菌会分解尿素使pH升高, 但白色念珠菌不影响Uu的液体培养显色［12］。除杂菌污染外, 泌尿生殖道外用药物也会使培养基pH升高或降低造成支原体培养的假阳性和假阴性。本次研究发现, 如果以固体培养为标准, 液体培养检测Uu和Mh均有假阳性出现。

传统固体培养法是先经液体培养疑似阳性后再转种固体培养基培养24~48 h观察有无典型支原体菌落再报告［13］。该方法虽可以保证支原体培养的准确性, 但明显延长检测的TAT(turnaroundtime)时间, 不能满足门诊病人的诊断和治疗需求。本研究采用原始标本同步接种液体培养和固体培养基,可明显缩短培养的检测周期。有研究显示该固体培养基超过85%的支原体可在24 h内看到典型菌落［14］。但固体培养基的敏感性不如液体培养基, 单独使用固体培养基会造成漏检, 转种变红的液体培养基可以弥补这一缺陷。需要注意的是, Mh在液体培养基中分解精氨酸, pH>7.8易死亡, 延迟转种会导致固体培养假阳性, 因此一旦观察到液体变红应立即转种。

综上所述, 同步接种液体和固体培养基, 不仅能减少液体培养的假阳性, 转种疑似阳性培养液还能提高固体培养基的敏感性, 两者相互补充, 联合使用能达到为临床快速提供准确检验结果的目的。但联合培养仍不能区分Uu的两个亚型：Parvo生物型(Up)和T960生物型(Uu), Up常定植于健康人群。如果临床没有生殖泌尿系统感染症状, 即使分离出Uu, 也不能盲目使用抗生素, 以避免耐药菌的产生。