福鼎大白茶高效离体再生体系的优化

吴婉婉 ，孙威江 ，陈志丹

1.福建农林大学园艺学院，350002；2.陕西果业集团有限公司，710000；3.福建农林大学安溪茶学院，350002；4.福建省茶产业工程技术研究中心，350002；5.福建省茶产业行业技术开发基地，350002

茶树组织培养始于20世纪60年代，英国剑桥大学以茶树幼嫩茎段为离体材料研究离体咖啡碱的合成[1]。我国茶树组织培养研究起步较晚，但近年来也取得了显著进展。袁地顺等[2]用福云6号和福鼎大毫茶2个茶树品种的根尖和茎尖为外植体诱导愈伤组织，发现两者都能诱导出愈伤组织，其中嫩茎的诱导效果较好。陈玉玲等[3]分别用茶树叶片、茎段为外植体进行愈伤组织诱导，发现茎段愈伤组织的诱导效果优于叶片，最佳的诱导愈伤组织培养基为MS+0.4 mg/L 6-BA+2 mg/L 2，4-D。江昌俊等[4]用茶树成熟胚为外植体进行组织培养，先诱导其产生愈伤组织，再诱导愈伤组织分化出芽，最后诱导芽长根，试验得出6-BA、2，4-D诱导产生的愈伤组织质量较好，最高出愈率可达97%。彭正云等[5]以大田茶树的根作为组织培养的外植体，诱导其先产生愈伤组织，再分化出发状根。李家华等[6]以云南地区大叶种茶树带腋芽新梢诱导腋芽萌发，结果发现诱导腋芽和愈伤组织的最佳培养基分别是：MS+0.5 mg/L 6-BA+4 mg/L 2，4-D 和MS+10 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

福鼎大白茶是我国目前推广面积最大、综合性状优良的茶树品种，也是最通用的茶树遗传资源[7]，但目前尚未见该品种完整再生体系的系统研究。试验以福鼎大白茶幼嫩茎段为材料，主要研究了不同激素组合对腋芽的诱导等，找出适合腋芽诱导、增殖和生根的最佳培养基，以便获得完整的再生植株，为珍稀茶树种质资源的离体保存及茶叶科研提供基础和高纯度无菌材料。

一、材料与方法

1.材料与试剂

以春、秋季生长带饱满腋芽的福鼎大白茶茎段为材料。

主要试剂：95%无水乙醇、氯化汞等。

仪器设备：电磁炉、自动高压蒸汽灭菌锅G154DS（致微厦门仪器有限责任公司）、纯水器、超净工作台（苏净安泰）、接种器具消毒器（上海稼丰园艺用品有限公司）。

2.试验方法

（1）材料预处理

将所采集的用于腋芽诱导的材料剪去叶片和上、下端较嫩和较老的部分，留中间带2～3个腋芽长度的茎段，将材料置于烧杯中，先用洗衣粉水浸泡3～5 min，清洗掉表面尘土污垢（必要时用软毛刷轻轻刷材料的表面），倒掉洗衣粉水，在烧杯上面蒙上纱布，自来水下冲滴1.0～1.5 h，再用蒸馏水冲洗1遍，在烧杯外喷洒酒精，后置于超净工作台内（超净工作台事先进行紫外灯灭菌25 min左右），备用。

（2）腋芽诱导

消毒处理后的材料切成0.5 cm长带1个腋芽的茎段，接种于含有不同浓度激素（6-BA、NAA）的培养基上，试验采用L9（34）正交设计，每个处理接种10个外植体，重复3次，20 d后调查并记录萌芽率和生长状况。

萌芽率∕%=（萌芽外植体个数∕接种外植体总个数）×100

（3）不定芽增殖

以初代培养外植体萌发的小芽为材料，留1～2片叶子切下，进行继代培养。主要探讨不同激素6-BA （0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L）、NAA（0.1 mg/L、0.5 mg/L）的浓度组合对福鼎大白茶不定芽增殖的影响。

（4）生根培养

以增殖培养后高度大于2 cm的茶苗为材料，在生根培养基上进行诱导生根，探索不同激素组合对生根的影响。试验以1/2 MS为基础培养基，附加琼脂6.5 g/L、蔗糖30.0 g/L、pH值5.6～5.8，并添加不同质量浓度的IBA（0.25 mg/L、0.50 mg/L、0.75 mg/L、 0.10 mg/L）和 NAA （0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L）来诱导生根。试验设置9个处理，每处理重复3次，50 d后调查生根率、平均发根数和平均根长。

生根率∕%=（生根数∕接种数）×100

（5）练苗移栽

在生根培养基中培养一段时间后，将组培苗带瓶子一起置于通风的室内练苗。练苗后将整株小苗从培养瓶中取出植入事先准备好的砂质黄土中。

二、结果与分析

1.不同激素组合对福鼎大白茶腋芽诱导的影响

福鼎大白茶外植体接种后第二、第五、第七周的生长状况如图1。从图1可见，外植体接种后第二周后腋芽开始萌发，接种后第五周腋芽展开2片真叶，接种后第七周腋芽展开3片真叶。

图1 福鼎大白茶外植体接种后第二周（左）、第五周（中）、第七周（右）的生长状况

对不同的6-BA、NAA质量浓度配比对外植体腋芽诱导结果如表1。从表1中可知，6-BA、NAA、琼脂3个因素对萌芽率的影响依次为：6-BA＞NAA＞琼脂。方差分析结果表明，6-BA对诱导腋芽萌发效果最为显著，芽体生长正常，NAA和琼脂的作用不显著。由此可得出诱导茶树腋芽萌发的最佳培养基组合为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L琼脂。

2.不同激素组合对福鼎大白茶不定芽增殖的影响

对不同的6-BA、NAA浓度配比对外植体不定芽增殖效果进行邓肯多重比较，结果见表2。

从表2中可见，不同的6-BA、NAA浓度配比对外植体不定芽的增殖有显著性差异。Z3、Z5处理与其他各处理间增殖倍数达到极显著性差异。Z3和Z5处理间也存在极显著性差异，其中Z3处理的增殖倍数达到4.0，Z5处理的增殖倍数为1.9。其中，Z3处理外植体不定芽增殖培养4周后的生长状况如图2。

表1 腋芽诱导正交实验结果

图2 Z3处理外植体不定芽增殖培养4周后的生长状况

表2 不定芽增殖倍数的邓肯多重比较

总体来看，Z3和Z5处理的培养基较适合不定芽的增殖，且芽的生长状况也较其他处理的好，也就是当培养基中6-BA质量浓度为1.0～1.5 mg/L，NAA质量浓度为0.1 mg/L时，较适合不定芽的增殖。

3.不同激素组合对组培苗生根的影响

将组织培养获得的无根小苗接入生根培养基培养40 d左右，在基部产生白色点状突起，50 d时肉眼可看到白色的根伸出。不同IBA、NAA激素配比处理对组织培养苗根的诱导效果见表3。

表3 不同激素配比处理对组织培养苗根的诱导效果

从表3中可以看出，只有S4、S5培养基能够诱导组织培养苗长出根（图3），其他培养基对组织培养苗根的诱导效果为0。其中，S4的平均生根率为11.11%，平均根长1.4 cm；S5的平均生根率为77.78%，平均根长达5.4 cm，根粗壮。

图3 福鼎大白茶组培苗生根培养发根状况

由此可知，最适的诱导茶树组织培养苗生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA，附加琼脂6.5 g/L，pH值调至5.6～5.8。

4.组培苗生根后的练苗移栽

组培苗在生根培养基中培养一段时间后，待不定根长度＞3 cm时，开始进行练苗。先将组培苗带瓶子一起置于通风的室内练苗3～5 d，之后，再将瓶盖旋开练苗2 d，最后将整株小苗从培养瓶中慢慢取出，用自来水轻轻地将附在根部的琼脂培养基冲洗干净，植入事先准备好的砂质黄土中，避免残留的培养基引发杂菌的滋生，尽量避免伤到组培苗的根。移栽后将其放置在室内靠窗位置，以利于通风，同时应根据天气情况适时浇水。

三、结论

植物组织培养中，细胞分裂素6-BA对不定芽分化、增殖有较显著的作用。通常情况下，较高浓度的细胞分裂素与较低浓度的生长素配合使用，有利于芽的分化；相反，当二者的比值高时，则有利于愈伤组织的形成和根的分化[8]。本研究得出诱导芽的较适培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

在进行植物组织培养时，外植体已经选定，接下来的主要工作就是培养基以及植物生长调节剂的选择。常用的培养基有MS、WPM、B5等[9]。茶树属于木本植物，对木本植物进行组织培养时，通常采用的是MS培养基或在其基础上加以改良。如郭玉琼等[10-11]、袁正仿等[12]以茶树带腋芽茎段为外植体进行茶树离体培养时，先在MS培养基上诱导出腋芽，再在1/2 MS培养基上诱导出根，最后获得完整植株。试验得出最佳的增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA，生根率可达77.78%，平均根数4条，平均根长为5.4 cm。