茶树带腋芽茎段组织培养研究

刘 静

(安康学院 现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000)

茶树[Camelliasinensis(L.)O．Kuntze]属山茶科山茶属多年生木本植物[1]。茶叶为我国重要的饮料作物，茶叶中的茶多酚类、植物碱、蛋白质、氨基酸、维生素等有机化学成分和无机矿物元素具有很高的价值[2]。茶树为异花授粉，其高度的自交不亲合性、自交衰退、结实率低等因素限制了遗传改良工作的进行[3]。茶树按照繁殖方式的不同分为种子繁殖和无性繁殖，种子直播简单易行，成本低廉，但是由于茶树容易发生性状分离导致优良性状丢失，对茶园的长久发展带来了很大的困难。无性繁殖以扦插为主，但是该方法在育苗周期、繁殖系数、对自然环境的要求方面有一定的缺陷，在茶树新品种育成时，先需要经过多年的原种扩繁，等完成一定规模后，才能进行大面积栽种，这使得茶树新品种的繁育和推广速度受到限制[4]，利用植物组织培养来生产种苗，不仅可以保持优良性状，缩短育种年限，实现快速繁殖，还可以避免环境对育种时间的限制，实现批量化、大规模生产。在茶树的繁殖过程中，利用植物组织培养技术对叶片、茎段、腋芽以及根等外植体进行诱导来获得完整的植株，再进行移栽。为建立茶树高效组织培养体系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为“陕茶一号”茶树幼嫩枝条，由安康市双龙镇三星茶厂提供。

1.2 方法

取茶树幼嫩枝条，切至长2 cm左右的带芽茎段，将带芽茎段流水冲洗2 h，在超净工作台中用75%的酒精消毒30 s，再用0.1%氯化汞消毒灭菌8 min，用无菌水冲洗5～6次后接种于不同培养基中进行培养，培养温度为(25±1)℃,光照8～10 h·d-1，光照强度1 500～2 000 lx。

1.2.1 不同取材时间对茶树腋芽诱导的影响 分别于4月上旬、5月上旬、6月上旬取茶树幼嫩茎段，将消毒过的茎段接种在MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1培养基上，每个月份的材料接种20瓶，每瓶接种2～3个外植体，重复三次。接种40 d后比较不同取材时间对茶树腋芽诱导的影响，统计腋芽诱导率。

腋芽诱导率(%)=(分化出腋芽的外植体数/未污染外植体总数)×100%

1.2.2 外植体不同放置方式对茶树腋芽诱导的影响 将茶树带腋芽茎段灭菌以后接种在MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1培养基上，共接种40瓶，每瓶2～3个外植体，其中20瓶培养基中茎段水平放置，另外20瓶培养基中茎段基部插入培养基，重复三次。观察腋芽的生长情况，40 d以后比较茎段不同放置方式对茶树腋芽诱导的影响，统计腋芽诱导率。

腋芽诱导率(%)=(腋芽萌发的外植体数/外植体总数)×100%

1.2.3 附加不同浓度激素的MS培养基和1/2MS培养基和对茶树腋芽诱导的影响 将消毒过的带腋芽茎段接种到不同的培养基(1.MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-12.MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-13.MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-14.MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-15.1/2MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-16.1/2MS+BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-17.1/2MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-18.1/2MS+BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1)上。每瓶培养基中接种2～3个外植体，每种培养基接种20瓶。重复三次。接种40 d后统计腋芽诱导率，比较不同培养基对茶树腋芽诱导的影响。

腋芽诱导率(%)=(分化出腋芽的外植体数/未污染外植体总数)×100%

2 结果与分析

2.1 不同取材时间诱导对茶树腋芽诱导的影响

从表1中可以看出，4月上旬茶树腋芽诱导率为71%，5月上旬腋芽诱导率为88%，6月上旬腋芽诱导率为77%。与4月和6月相比，5月份外植体诱导率较高。茶树为多年生灌木，其最适的生长温度为20～30℃，4月份气温开始回升，茶树开始抽枝生长,处于生长初期的枝条比较幼嫩，在消毒过程中容易受到损伤，不利于腋芽的诱导。5月气温上升，雨水充沛，利于茶树生长,茶树枝条达到15～20 cm，节间较长较嫩，脱分化能力强。6月份温度继续升高，茶树生长较快，枝条逐渐木质化，脱分化能力弱，不利于茶树腋芽诱导。因此,5月份的茶树枝条更有利于腋芽诱导，且诱导出腋芽所需的时间短，芽的长势也好。

2.2 比较茎段的不同放置方式对茶树腋芽诱导的影响

从表2可知，茎段不同的放置方式对茶树腋芽诱导率的影响不同。水平放置培养的茎段，腋芽的萌发率是83%，基部插入培养基培养的茎段，腋芽的萌发率是36%。从实验结果可知，茎段水平放置培养，腋芽的萌发率更高，可能的原因是材料水平放置，增加了材料与培养基的接触面积，有利于营养物质的吸收，材料基部插入培养基中培养的方式，材料与培养基的接触面积较少，材料吸收培养基中营养物质少且慢，导致腋芽生长发育缓慢。所以将材料水平放置更有利于茶树腋芽的诱导。

表2 茎段的不同放置方式对茶树腋芽诱导的影响

2.3 附加不同浓度植物激素的MS培养基和1/2MS培养基对茶树腋芽诱导的影响

实验以MS和1/2MS为基本培养基，在含有NAA和6-BA的培养基上，带芽茎段接种一周后，茎段开始膨大(图1A)；外植体培养20d后，切口有少量愈伤组织出现，腋芽萌发(图1B)；培养40 d后，腋芽叶片开始舒展(图1C)，接种90 d后，腋芽发育成有5～6片真叶的枝条(图1D)。由表3可以看出：MS培养基中，6-BA浓度为2.0 mg·L-1，NAA浓度为0.5 mg·L-1时，诱导率最高，为92%。因此，在MS基本培养基中，腋芽诱导的最适激素浓度配比为：6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1.在1/2MS的培养基中，6-BA浓度为2.0 mg·L-1，NAA浓度为0.2 mg·L-1的诱导率较高，为88%。因此，当基本培养基为1/2MS时，腋芽诱导的最适浓度配比为：6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1。

表3 不同的植物激素对腋芽诱导的影响

3 结论与讨论

3.1 茶树外植体取材时间对腋芽诱导的影响

目前，关于茶树茎段组织培养的研究报道较少，茶树在不同时间取材，腋芽诱导率有明显差异，王树芝[5]等研究发现，与8月份和10月份相比，5月份取材的外植体腋芽萌动最快,萌发率最高，10月份取材的外植体腋芽萌动最慢,萌发率最低，8月份取材的外植体的腋芽萌发时间和萌发率介于5份月和10月份之间,本次实验研究发现5月份茎段腋芽的诱导率明显高于4月份和6月份。且5月份茎段腋芽诱导所需的时间也比4份月和6月份短，这与王树芝等研究结果相似，综上所述，在茶树茎段腋芽诱导中，带芽茎段的最佳取材时间为5月，在此期间取材培养，腋芽诱导率较高。

3.2 不同浓度植物激素对茶树腋芽诱导的影响

研究发现培养基中植物激素的种类和浓度会对外植体的分化能力产生影响，高浓度生长素会促进愈伤组织的形成，而愈伤组织的形成会降低增殖率，高浓度的细胞分裂素会抑制愈伤组织的形成，但对芽的诱导和生长有一定的促进作用。李家华等[6]以大叶种茶树新梢为外植体，认为6-BA0.5 mg·L-1+2.4-D4.0 mg·L-1促进腋芽形成单生芽的效果最好,6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1诱导愈伤组织形成和腋芽分化均获得较好效果,6-BA4.0 mg·L-1对促进丛芽形成效果最好。袁正仿等[7]以薮北茶树带腋芽的茎段为外值体,认为最佳腋芽诱导培养基为MS+6-BA2.0 mg·L-1，芽增殖培养基为MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1，在此次实验中，培养基中添加的生长素是萘乙酸(NAA)，细胞分裂素是6-BA，通过对比附加不同植物激素的培养基对腋芽诱导的影响,我们发现：在MS培养基上，NAA和6-BA的浓度都较高时，腋芽的诱导率较高，说明在MS培养基上附加较高浓度的植物激素可以促进腋芽的诱导；在1/2MS培养基上，NAA浓度较低和6-BA浓度较高时，腋芽的诱导率较高，而NAA和6-BA浓度都为高浓度时，腋芽诱导率明显下降，说明在1/2MS培养基上，腋芽诱导所需的植物激素有一个最适浓度，超过这个浓度范围，腋芽诱导率会明显降低。以1/2MS为基本培养基的四种培养基的平均腋芽诱导率要稍优于以MS为基本培养基的平均腋芽诱导率。