DNA甲基化检测及其在急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征中的临床应用分析

王明

[摘要] 目的 探讨DNA甲基化检测及其在急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）中的临床应用。方法 选取2016年5月～2017年5月我院收治的急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征患者40例为研究组，选取同期健康体检人员40例为对照组，比较两组研究對象DNA甲基化检测结果。 结果 研究组患者PAX6甲基化表达明显高于对照组健康人群（P<0.05），同时高危患者甲基化水平明显高于低危患者（P<0.05）；研究组患者GNDF甲基化表达明显高于对照组健康人群（P<0.05），同时高危患者甲基化水平明显高于低危患者（P<0.05）；研究组患者TJP1甲基化表达明显高于对照组健康人群（P<0.05），同时高危患者甲基化水平明显高于低危患者（P<0.05）。结论 急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征患者的PAX6、GNDF、TJP1表达均呈现出高甲基化状态，且表达水平与患者病情存在正相关，可以作为临床诊断及判断患者预后的依据。

[关键词] DNA甲基化；急性髓系白血病；骨髓增生异常综合征；表达； 血液系统疾病

[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）12-0001-04

Analysis on DNA methylation detection and its clinical application in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome

WANG Ming

Department of Hematology， Yuyao People's Hospital in Zhejiang Province， Yuyao 315400， China

[Abstract] Objective To investigate DNA methylation detection and its clinical application in acute myeloid leukemia （AML） and myelodysplastic syndrome （MDS）. Methods 40 cases of patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome who were admitted to our hospital from May 2016 to May 2017 were selected. 40 subjects receiving health examination during the same period of time were selected as the control group. The DNA methylation test results were compared between the two groups. Results The methylation expression of PAX6 in the study group was significantly higher than that in control group （P<0.05）. At the same time， the methylation level in high risk patients was significantly higher than that in low risk patients（P<0.05）； the methylation expression of GNDF in the study group was significantly higher than that in control group（P<0.05）. At the same time， the methylation level in high risk patients was significantly higher than that in low risk patients（P<0.05）； the methylation expression of TJP1 in the study group was significantly higher than that in control group（P<0.05）. At the same time， the methylation level in high risk patients was significantly higher than that in low risk patients（P<0.05）. Conclusion The expressions of PAX6， GNDF and TJP1 in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes are hypermethylated， and the expression level is positively correlated with the patient's condition， which can serve as a basis for clinical diagnosis and determination of prognosis.

[Key words] DNA methylation； Acute myeloid leukemia； Myelodysplastic syndrome； Expression； Hematological diseases

急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征属于恶性的血液克隆疾病，其病因为造血干细胞失去正常分化能力及增殖调节。若治疗不及时，患者常出现致命感染或器官浸润。AML以及MDS的具体作用机制仍不够明确，不同毒素代谢以及DNA修复是研究的重点。同时体外研究结果表明，基因突变在疾病发生发展过程中有重要的影响[1]。通常情况下，恶性肿瘤患者基因DNA的甲基化表达呈现出下降趋势，不过特定区域的基因则呈现出高甲基化特点。本研究旨在分析AML以及MDS患者的DNA甲基化表达情况，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年5月～2017年5月我院收治的急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征患者40例为研究组，男22例，女18例，年龄23～59岁，平均（36.2±1.3）岁，病程2～9年，平均（5.4±0.6）年，其中高危患者28例，低危患者12例。纳入标准：患者确诊符合急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征；未合并其他血液系统疾病；知情同意本研究。排除标准：合并恶性肿瘤患者；合并严重肝肾功能障碍患者；妊娠哺乳期女性。选取同期健康体检人员40例为对照组，男25例，女15例，年龄24～58岁，平均（35.4±1.2）岁。两组研究对象的一般资料比较，无明显差异（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理方法 采集研究对象骨髓标本3 mL，采集得到的标本首先使用肝素处理从而发挥抗凝效果，标本经过抗凝处理后进行核细胞的提取操作。若未能收集到患者或健康研究独享的新鲜骨髓标本，则需要选用冻存细胞或者染色体悬液[2]。

1.2.2 分离白细胞 将标本转移到离心管中，1000 g条件下持续离心10 min。去除上清血浆之后添加红细胞裂解液之后持续裂解3 min。1000 g条件下再次离心10 min后去除上清液，如果仍然存在红细胞需要再次进行裂解。添加10 mL的PBS磷酸缓冲液之后均匀进行吹打，离心10 min后去除上清液。添加PBS 2 mL之后转移到离心管中。10000转高速条件下持续离心30 s之后去除上清，-60℃条件下储存。

1.2.3 DNA提取 应用DNA试剂盒进行白细胞DNA的提取，从冰箱中取出研究对象骨髓标本，添加500 μL的裂解液，45℃条件下持续孵育15 min。取出完全裂解之后的骨髓标本，添加120 μL的蛋白沉淀剂，充分震荡之后10000 r/min持续离心10 min。将得到的上清液转移到EP管，使用异丙醇并且进行充分的震荡，后以 10000 r/min的速度持续进行离心处理3 min。

1.2.4 亚硫酸氢盐DNA修饰 应用EpiTect进行DNA标本的修饰。操作步骤方面，将Bisulfite分装管中添加1000 μL的去Rnase并混匀，之后添加DNA溶解，将Bisulfite所需成分添加到PCR管中。PCR管合上并且充分混匀，常温条件下放置。添加Protect Buffer时，若颜色从绿变蓝，即可停止添加，pH已经满足反应所需条件。之后行DNA的修饰反应，将PCR管放置到Thermal中，完成修饰反应后持续离心PCR管1 min。完成离心之后转移反应液到离心管中。将含有10 ng/mL的RNA BufferBL添加到离心管中，混匀后持续离心1 min。转移离心管中的溶液到Epitectspincolumns，10000 r/min持续离心30 s 后去除上清。添加Buffer BW 300 μL到各个spincolumn中，10000 r/min持续离心30 s 后去除上清。添加Buffer BD 300 μL到spincolumn中，合上盖子后常温条件下持续孵育30 min。10000 r/min持续离心30 s之后去除上清。若BufferBD中存在沉淀物，则不能直接添加到spincolumns中，每次使用BufferBD后需盖上瓶盖，避免同空气中的二氧化碳接触而发生酸化问题。添加BufferBW 300 μL到spincolumn中，最大转速离心1 min，10000 r/min持续离心30 s之后去除上清，将其放置到collectiontubes中，重復操作之后将spincolumns放置到新的collectiontubes中，10000 r/min持续离心2 min去除液体。打开spincolumns盖子并转移到离心管中，45℃条件下持续孵育10 min，每个spincolumns薄膜添加BufferEB 20 μL，10000 r/min持续离心2 min，洗脱纯化之后的DNA，为提高洗脱的效果从而加大DNA的产量，应当额外添加BufferEB 20 μL，将纯化之后的DNA-30℃条件下储存。

1.2.5 甲基化PCR 应用甲基化引物（M）以及非甲基化引物（U）PCR扩增硫化之后的DNA，反应条件方面，在80℃条件下进行预变性，持续时间为20 min，之后80℃条件下持续变性1 min，45℃条件下退火1 min，69℃条件下延伸30 s，反复进行30个循环后，69℃条件下延伸5 min，常温条件下保存PCR得到产物。

1.2.6 PCR产物电泳检测 取5 μL的PCR扩增产物，使用2.0%的琼脂糖胶，在110 V条件下持续电泳1 h，使用100bpMarker标记DNA的分子量，从而检测扩增片段。后对电泳得到的凝胶进行系统照像，分析电泳条带的灰度值（Int值），从而判断DNA的甲基化水平。

1.3观察指标

对两组研究对象的骨髓标本进行甲基化PCR，分别检测其PAX6基因、GDNF基因及TJP1基因的条带。

1.4 统计学方法

应用SPSS20.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检检，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组PAX6甲基化水平比较

研究组患者PAX6甲基化表达明显高于对照组健康人群（P<0.05），同时高危患者甲基化水平明显高于低危患者（P<0.05），见表1。

表1 两组PAX6甲基化水平比较（x±s，copies/10000abl copies）

2.2 两组研究对象GNDF甲基化水平比较

研究组患者GNDF甲基化表达明显高于对照组健康人群（P<0.05），同时高危患者甲基化水平明显高于低危患者（P<0.05），见表2。

2.3兩组研究对象TJP1甲基化水平比较

研究组患者TJP1甲基化表达明显高于对照组健康人群（P<0.05），同时高危患者甲基化水平明显高于低危患者（P<0.05），见表3。

表3 两组研究对象TJP1甲基化水平比较

（x±s，copies/10000abl copies）

3讨论

急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征是一种常见的血液系统疾病，支持治疗、传统化疗及干细胞移植治疗为常用的治疗方法，但化疗易导致出现耐药及复发问题，而移植造血干细胞的失败几率较高，患者的死亡风险同样较高，治疗效果均不够理想[3-4]。随着临床上DNA甲基化相关研究的日益深入，各种去甲基化治疗的药物种类越来越多，同时逐渐应用于白血病患者的治疗过程中。DNA甲基化指的是DNA在转移酶（DNMT）的影响作用下，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）能够源源不断地提供甲基从而转化成为5-甲基胞嘧啶，不断合成甲基化DNA[5-6]。甲基化产物能够形成CpG位点，而相关研究的结果提示，人类的基因组中包含2000万以上的CpG位点，有60%左右的CpG苷酸属于甲基化状态，少数非甲基化的CpG双核苷酸呈现出集聚的倾向，从而形成GC水平较高同时CpG苷酸比较密集的位置，研究人员称之为CpG岛[7]。CpG岛通常存在于基因启动子以及外显子的位置。

近年来随着对肿瘤发生发展具体机制的深入探讨，肿瘤基因启动子位置的甲基化对血液系统疾病的影响日益受到人们的重视[8-9]。基因启动子的高甲基化状态是影响急性髓系白血病患者的预后质量的重要风险因素。遗传学研究的结果表明，甲基化异常是部分白血病的典型特点，通常与已知染色体异位及基因突变存在联系[10-11]。研究人员发现白血病相关IDH基因突变会导致PAX6基因出现甲基化异常，且影响到造血干细胞的正常分化[12]。本研究结果显示，研究组患者PAX6甲基化表达明显高于对照组健康人群（P<0.05），同时高危患者甲基化水平明显高于低危患者（P<0.05），与相关研究结果相符。最新研究结果显示，髓系血液肿瘤患者的细胞株及白血病患者中，PAX6基因高甲基化同基因沉默存在不容忽视的联系。PAX6高表达在急性髓系白血病患者中出现的几率较高，正常突变通常情况下并不会设计甲基化[13]。本研究应用亚硫酸氢盐测序白血病患者的骨髓标本甲基化。这一技术与其他的DNA甲基化检测技术比较而言有着更高的灵敏度，借助于对基因组的DNA完成测序能够得到精确度比较高的甲基化图谱，同时也能够发现同基因激活或基因沉默存在联系的CpG位点具体位置，且分析甲基化情况，即能可靠直接地体现DNA的甲基化程度[14]。

研究发现，乳腺瘤患者及胶质瘤患者中的GNDF基因高表达且伴随着驱动子的高甲基化，并非高表达合并甲基化[15]。5-氮杂脱氧胞嘧啶核苷可以降低GNDF基因的甲基化水平，但在此过程中不会影响到GNDF的表达量。本研究结果发现，研究组患者GNDF甲基化表达明显高于对照组健康人群（P<0.05），同时高危患者甲基化水平明显高于低危患者（P<0.05），提示急性髓系白血病患者的骨髓GNDF基因甲基化水平要显著高于健康人群，而健康人群的GNDF基因甲基化水平比较低。研究发现，抑癌基因高甲基化是血液恶性肿瘤发生发展的重要影响因素，DNA甲基化能够改变DNA结构，不过并不会对DNA序列带来影响[16]。近年来临床上去甲基化药物如地西他滨及阿扎胞苷在白血病等血液系统疾病治疗中的应用日益广泛，主要借助于逆转甲基化的过程，从而重新激活抑癌基因，发挥白血病治疗效果[17]。

本研究结果提示，研究组患者TJP1甲基化表达明显高于对照组健康人群（P<0.05），同时高危患者甲基化水平明显高于低危患者（P<0.05），提示TJP1甲基化异常在AML/MDS发生发展的过程中有不容忽视的重要影响。同肿瘤遗传学不同的是，人体表观遗传学层面出现的改变，可以借助药物来改变其表达水平[18-19]。PAX6（pairedbox6）基因全称为配对核因子6基因，属于PAX转录因子家族的重要组成部分。GDNF属于TGF-β家族，相关研究结果表明PAX6及GDNF基因在MDS患者的身体内部存在着高甲基化的倾向。TJP1属于ZO-1基因，随着患者肿瘤恶性程度的上升而呈现出表达水平降低的趋势，表明该基因与肿瘤演进存在密切联系。总之，DNA甲基化异常在血液系统疾病发生过程中有重要作用，主要体现在抑癌基因甲基化水平的上升[20]。DNA启动子位置甲基化异常能作为患者病情诊断的生物学标志物，因此，对DNA甲基化的研究对诊断及治疗恶性血液疾病有重要的临床价值。地西他滨是临床上常用的去甲基化药物之一，在恶性血液病治疗领域取得理想应用效果，高剂量用药与化疗药物的细胞毒性类似，同时骨髓抑制作用也较明显，低剂量用药则主要实现去甲基化的影响，从而控制肿瘤细胞增殖。不过当前情况下AML/MDS去甲基化的致病作用机制还需要后续研究，去甲基化治疗也需要进一步的研究加以证实。

综上所述，急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征患者的PAX6、GNDF、TJP1表达均呈现出高甲基化状态，且表达水平与患者病情存在正相关，可以作为临床诊断以及判断患者预后的依据。

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（收稿日期：2017-12-08）