桑芪首乌片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积及脑组织形态病理的影响❋

顾力华，杨仁华，陈奇刚，魏丹霞△，余晓玲，陆家龙

(1. 昆明市中医医院，昆明 650500； 2. 昆明医科大学，昆明 650500)

桑芪首乌方是国家级名中老医陆家龙主任医师的经验方，该方具有补肝肾、旺精血、充髓海、祛瘀通络的功效，可治疗中风病之肢体偏瘫，临床应用数十年获得较好疗效。本实验通过由桑芪首乌方制备成的桑芪首乌片，观察其对大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)后脑缺血-再灌注损伤大鼠脑梗死体积及脑组织形态病理的影响，以探讨该方对脑梗死患者神经保护作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验药物及其配制

桑芪首乌片(主要包括桑寄生、首乌、黄芪等，由昆明市中医医院制剂科提供)、天麻钩藤颗粒、尼莫地平片(20 mg/片)。

桑芪首乌片高剂量组：准确称取桑芪首乌片14 g加入蒸馏水制成混悬液，定容至100 mL。桑芪首乌片中剂量组：准确称取桑芪首乌片7 g加入蒸馏水制成混悬液，定容至100 mL。桑芪首乌片低剂量组：准确称取桑芪首乌片3.5 g加入蒸馏水制成混悬液，定容至100 mL。天麻钩藤颗粒对照组：准确称取天麻钩藤颗粒10 g，加入蒸馏水制成混悬液，定容至100 mL。尼莫地平片对照组：准确称取尼莫地平片38.5 mg，加入蒸馏水制成混悬液，定容至100 mL。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠70只，体质量 180～220 g，由昆明医科大学实验动物部提供(动物合格证号 SCXK(滇)2012 -0016)。

1.3 主要试剂

多聚甲醛购自天津科密欧化学试剂公司(批号20150828)、水合氯醛购自天津光晨精细化工研究所(批号20150924)、TTC购自美国Biosharp公司(批号40765)。

1.4 主要仪器

电热恒温培养箱(中国上海精宏实验设备有限公司)、显微镜(日本奥林巴斯)。

1.5 方法

1.5.1 MCAO动物模型制备 SD大鼠经适应性喂养1周后开始造模。实验前动物禁食12 h，自由饮水。参照相关文献[1-5]，采用改良线栓法制备MCAO大鼠模型(局灶性脑缺血再灌注模型)。SD大鼠用10%水合氯醛按0.35 ml/100 g(B.W.)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈部手术区剔毛。沿颈中线切口分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉。用微动脉夹暂时夹闭颈内动脉，然后近心端结扎颈总动脉和颈外动脉。在颈总动脉距其与颈内动脉交叉4 mm 处剪45°斜口，将拴线插入到颈内动脉从血管分叉处计算，插入长度18 mm时要放松血管保持原来状态，再轻轻往前插，当稍有阻力增大即停止插入。颈内动脉打结，防止线栓滑脱。缝合各层组织，使线的一端露出皮肤约0.5 cm，缺血2 h拔出线栓形成再灌注损伤。假手术对照组动物仅沿颈中线切口，不分离血管和结扎。在大鼠清醒后用Bederson评分分级法观察其神经行为学变化，凡评分≥2分者说明造模成功并纳入本实验。

1.5.2 分组及给药 将造模成功后的大鼠按随机数字表法分为MCAO模型对照组、尼莫地平片对照组、天麻钩藤颗粒对照组、桑芪首乌片高剂量组、桑芪首乌片中剂量组、桑芪首乌片低剂量组、假手术对照组7组各10只。

造模后24 h内开始第1次灌胃给药，将药物制成混悬液灌胃。桑芪首乌片高剂量组相当于含生药16 g/kg，桑芪首乌片中剂量组相当于含生药8 g/kg，桑芪首乌片低剂量组相当于含生药4 g/kg，尼莫地平片对照组给予尼莫地平片7.7 mg/kg，天麻钩藤颗粒对照组给予天麻钩藤颗粒2 g/kg，MCAO模型对照组和假手术对照组给予等体积蒸馏水，灌胃容量按10 mL/kg体质量计，每天1次，连续6周。

1.5.3 标本的取样 实验结束即第6周后禁食12 h，将大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉后迅速从后颈处断头处死，逐层分离取出大脑，放入4%多聚甲醛中4 ℃保存。石蜡切片前切成2～3 mm厚的小块，并在不同酒精浓度下脱水，后放入二甲苯2次，65 ℃石蜡，室温冷却后切片。

1.5.4 神经行为学评分 采用Bederson评分分级法，于术后当日、术后第3周、第6周分别对各组大鼠进行神经行为学评分并记录结果。

1.5.5 大鼠脑梗死体积测定及脑组织形态病理观察 取大鼠左侧大脑组织，4%中性甲醛固定、包埋、切片、HE染色，显微镜下进行组织学观察。按冠状切面顺序切5片，每片2 mm，将脑片置于TTC溶液中，放入恒温振荡器37 ℃ 30 min充分染色。取出脑片拍照，用显微图像分析系统计算梗死面积(粉红色为未受损的正常脑组织，而梗死区则因线粒体损害而不染色，呈白色)。脑梗死灶体积(mm3)=总梗死面积(mm2)×脑片厚度(mm)。水肿修正后的脑梗死灶体积(mm3)=梗死体积×对侧半球体积/同侧半球体积。梗塞率(%)=水肿修正后的脑梗死灶体积/双侧大脑半球体积×100%。

2 结果

2.1 桑芪首乌片对MCAO大鼠神经行为学评分的影响

表1显示，假手术对照组大鼠在整个实验过程中均未出现神经行为异常表现，评分均为0分。MCAO模型复制完成后与假手术对照组比较，MCAO模型对照组评分明显增高(P<0.05)，与MCAO模型对照组比较，桑芪首乌片高、中、低剂量组、尼莫地平片对照组、天麻钩藤颗粒对照组评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药3周后，与假手术对照组比较，MCAO模型对照组评分明显增高(P<0.05)，与MCAO模型对照组比较，桑芪首乌片高、中剂量组、尼莫地平片对照组、天麻钩藤颗粒对照组评分明显降低(P<0.05)。给药6周后，与假手术对照组比较，MCAO模型对照组评分进一步增高(P<0.05)，与MCAO模型对照组比较，桑芪首乌片高、中剂量组、尼莫地平片对照组、天麻钩藤颗粒对照组评分明显降低(P<0.05)。

表1 桑芪首乌片对MCAO大鼠神经行为学评分影响

2.2 桑芪首乌片对MCAO大鼠脑组织形态病理的影响

图1显示，假手术对照组细胞结构完整，细胞排列整齐，细胞核居中，核膜、核仁清晰；MCAO模型对照组细胞排列紊乱，细胞核碎裂、溶解、消失，细胞坏死明显；尼莫地平片对照组和天麻钩藤颗粒对照组可以发现，细胞坏死及细胞排列紊乱，但坏死范围明显比MCAO模型组减小；桑芪首乌片高、中、低剂量组随剂量增加，坏死细胞比MCAO模型组明显减少。

图1 各组大鼠脑病理形态学比较(免疫组化×400)

2.3 桑芪首乌片对MCAO大鼠脑梗死灶大小的影响

图2表2显示，与假手术对照组比较，MCAO模型对照组的梗死体积、修正后梗死体积和梗死率均明显增高(P<0.05)。给药6周后，与MCAO模型对照组比较，桑芪首乌片高、中、低剂量组、尼莫地平片对照组、天麻钩藤颗粒对照组的梗死体积、修正后梗死体积和梗死率均明显降低(P<0.05)。

图2 各组脑梗死灶比较

表2 桑芪首乌片对MCAO大鼠脑梗死灶大小的影响

3 讨论

脑梗死后导致脑神经损伤的过程是一个多环节、多因素、多途径的复杂过程。研究认为，脑梗死中脑缺血再灌注损伤表现为脑梗死面积增大、脑组织形态病理改变及神经功能行为异常[6]。虽然当前神经保护剂种类繁多，但众多临床试验结果均为阴性，故神经保护剂的研发成为当前治疗脑梗死的难点。

众多研究表明，复方中药具有抗脑缺血再灌注损伤、促进神经功能恢复的作用。路畅等采用小续命汤有效成分干预MCAO大鼠，结果显示小续命汤有效成分高剂量组降低MCAO大鼠脑梗死体积的效果最好，同时能够明显减少MCAO大鼠缺血半暗带和核心区脑匀浆的过氧化物丙二醛含量和降低一氧化氮合酶活力，提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力，从而产生神经保护作用[7]。韩宁等认为，肝肾阴虚、气血衰少是致病之本，拟定了具有益气填精、荣络活血功效的荣络健脑饮(人参、鹿茸粉、龟甲、麦冬、菖蒲、川芎、赤芍、大黄、冰片)治疗中风。研究结果表明，荣络健脑饮可减轻脑缺血再灌注损伤造成的病理改变，降低脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损程度评分，促进脑组织神经生长因子、脑源性神经营养因子、碱性成纤维生长因子的表达，减轻脑缺血再灌注损伤，发挥神经保护作用[8]。

桑芪首乌方是云南省荣誉名中医陆家龙主任医师临床应用数十年的经验方。方中桑寄生味苦、性平, 归肝肾经，补肾养血而可益肝肾、强筋骨之功效，偏走于肢体筋脉；制首乌味苦、甘、性微温，归肝肾经，善补肝肾、益精血，可治疗中风病之肢体强急拘挛或筋骨赢弱瘫软诸症，配伍黄芪等以益气活血化瘀。诸药配伍肝肾得补，精血得旺，髓海得充，瘀去络通，且滋补而不留邪，降泻而不伤正，补中有泻，寓泻于补。

桑芪首乌片对MCAO大鼠脑组织病理形态学具有改善作用，同时能减少脑梗死的体积，这可能是MCAO模型大鼠神经行为学评分改善的基础，但桑芪首乌片作用机制还有待进一步的深入研究。