芬戈莫德在脑白质缺血损伤中的神经保护研究

秦 川， 樊文慧， 刘 倩， 张 强

脑血管疾病是世界上第三大死亡原因[1]，具有复发率高、致残率高和死亡率高的“三高特征”。脑血管疾病分为出血性和缺血性脑血管疾病，缺血性疾病占脑血管疾病的60%～80%，众所周知的是缺血性脑血管疾病会导致灰质损伤，然而越来越多的研究发现慢性脑缺血主要引起脑白质损害[2]。相对灰质损伤而言，对白质损害的研究在很大程度上处于被忽视的状态，所以我们迫切需要开始研究治疗白质损害的方法。缺血性脑白质损伤是一个复杂的病理生理过程，大量研究发现，缺血性脑白质损伤以胶质细胞增生及髓鞘不同程度脱失为基本特点[3]。

芬戈莫德(FTY720)是一种口服的免疫抑制剂，美国食品和药物管理局于2010年9月准许此药作为治疗多发性硬化的一线药物[4]。在多发性硬化动物模型中FTY720被证明可通过促进少突胶质细胞生长、成熟及髓鞘再生而治疗多发性硬化[5]。另外，最近研究表明患者口服FTY720可以治疗出血性脑血管病和缺血性脑血管病，轻到中度脑出血患者在72 h内口服FTY720可以减弱疾病进展、促进恢复[6]，急性缺血性卒中患者在72 h内口服FTY720可抑制组织的第2次损伤、减缓疾病的进展、促进恢复[7]。研究推测FTY720治疗脑血管疾病的主要机制是其抗炎作用[6,7]。因此，我们猜想FTY720可能对低灌注引起的缺血性脑白质损伤有保护作用且这种作用机制可能与抑制神经炎性有关。鉴于以上猜想，本研究通过小鼠低灌注脑白质损伤模型的建立，研究FTY720对低灌注脑白质损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年的SPF级C57BL/6J雄性小鼠，10 w大小，体重(23～25)g，从华中科技大学附属同济医学院动物实验中心获得。

1.2 主要试剂及材料 微型弹簧(日本SAWANE弹簧有限公司)，FTY720(美国Cayman生物公司)，固蓝(LFB)染液(武汉谷歌科技有限公司)，兔抗 Iba-1 单克隆抗体(wako公司)，大鼠抗小鼠CD68多克隆抗体(BD公司)。

1.3 小鼠双侧颈总动脉狭窄(bilateral common carotid artery stenosis,BCAS)模型建立 小鼠BCAS模型按照前人的方法进行适当的改良[8]，步骤简述如下：该模型的主要特点是用内径为0.18 mm微型弹簧狭窄颈总动脉；小鼠腹腔注射麻醉剂后，将小鼠固定于手术台上，消毒、备皮，在颈中线位置切口，使颈总动脉暴露出来，再用两根4号线放在颈总动脉下方，然后轻轻的将颈总动脉提起，将微型弹簧旋转、套扎到颈总动脉上，完成一侧后，用同样的方法狭窄另一侧颈总动脉。整个过程不应超过10 min，小鼠的温度维持在36.5 ℃和37.5 ℃之间。

1.4 给药 于造模后24 h内开始，治疗组给予 0.3 mg/kg 的FTY720腹腔注射，每天一次，连续3 d，10 d及一个月。

1.5 Luxol Fast Blue(LFB)染色 用LFB染色观察脑白质区髓鞘的改变，步骤简述如下：取出小鼠冰冻切片后将小鼠脑组织标本用4%多聚甲醛溶液固定15 min，再梯度(75/95/100%)乙醇脱水，脱水后将冰冻切片放入预先准备好的LFB溶液中于60 ℃的烤箱孵化8 h，从LFB溶液中取出切片后用0.05% Li2CO3分色，梯度(75/95/100%)酒精脱水，二甲苯透明15 min，最后中性树胶封片。

1.6 免疫荧光染色 小鼠麻醉取脑后快速放入异戊烷中速冻，然后将小鼠大脑用冰冻切片机冠状面切成厚度为10 μm的切片，将小鼠脑组织切片以4%多聚甲醛固定15 min后，用0.25% Triton X-100破膜液室温破膜15 min，再用封闭液(PBS含1%BSA，0.1%Triton)室温下封闭60 min，加入兔抗小鼠Iba1抗体(1∶200)，大鼠抗小鼠CD68抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜，用PBS洗3遍，每遍10 min，之后以相应的二抗(Cy3 标记的山羊抗兔 IgG，FITC标记的山羊抗大鼠 IgG)室温下避光孵育1 h，PBS洗3遍，每遍10 min；DAPI染色10 min，PBS洗3遍，每遍10 min；甘油封片，荧光倒置显微镜下观察。

1.7 八臂迷宫行为学试验 小鼠BCAS造模30 d后，通过八臂迷宫评估小鼠的记忆。采用Shibata M[10]报道的八臂迷宫实验方法进行改进。实验前小鼠先适应3 d，第4天起开始记录小鼠前8次访问不同臂的个数(first eight arm choice)，同时还要记录小鼠吃完八臂内食物时所有重复访问次数(revisiting errors,RME)一直到第10天，以上记为工作记忆错误(working memory error,WME)；从第11天起在固定的 2、4、6、8号臂内放置食饵，让小鼠自由觅食，记录吃到这几个臂内食饵前小鼠所犯的错误，这记为参考记忆错误(reference memory error,RME)。两种行为学检测方法都以吃完食饵或15 min结束作为一次试验。每实验组小鼠为8只，实验结束后对不同组的记忆错误次数进行统计分析。

2 实验结果

2.1 FTY720对小鼠低灌注损伤后认知功能变化的影响 小鼠脑白质低灌注损伤模型(BCAS)成功建立后，FTY720对小鼠造模后认知功能的影响通过8臂迷宫行为学测试方法来检测。结果显示在小鼠吃完8个臂内食物前重复访问相同臂次数(revisiting errors)方面，FTY720治疗组明显低于溶剂组(见图1A)，而小鼠在完成该任务时前8次进入不同编号的臂的个数(first eight arm choices)方面，FTY720治疗组较空白对照(Vehicle)组增多(见图1B)，这两个实验结果说明小鼠在低灌注后给予FYY720治疗可以减少工作记忆错误(working memory error,WME)，也就说明FTY720治疗可以使小鼠短时记忆受损伤程度降低。在完成吃完4个固定臂内食饵任务中，3组小鼠重复进入4个固定臂时所犯错误没有明显差异，说明小鼠在BCAS术后对参考记忆错误(reference memory error,RME)(见图1C)无明显影响，也就是说明小鼠长时记忆在BCAS术后未见明显损伤。

2.2 FTY720对小鼠低灌注后白质区髓鞘结构改变的影响 对假手术组(Sham组)、空白对照组(Vehicle组)及FTY720干预组(FTY720组)的BCAS 组一个月的小鼠脑片进行LFB 髓鞘染色，对其损伤程度进行评分。不同白质区域LFB髓鞘染色结果显示：FTY720组小鼠可以减轻BCAS后小鼠在胼胝体中央区(CCm)、前联合(AC)、新纹状体(CPu)和内囊(IC)等区域中白质纤维束中的髓鞘脱失、白质纤维排列紊乱、空泡形成等白质损伤，与Vehicle组相比FTY720组小鼠的海马伞端(F)的白质损伤也有一定的减轻，但无明显统计学差异(见图2)。

2.3 FTY720对低灌注后小胶质细胞活化的影响 用Iba1、CD68标记的免疫荧光染色的方法检测FTY720对低灌注一个月后小胶质细胞活化及吞噬的影响，结果发现Vehicle组小鼠在低灌注后，白质区域小胶质细胞明显活化，吞噬增多，小胶质细胞数量明显增多，变化具有统计学意义；与Vehicle组相比，给予FTY720干预后损伤的白质区域中小胶质细胞数目减少，吞噬指标CD68表达明显降低，提示FTY720干预可抑制低灌注后小胶质细胞的活化、吞噬(见图3)。

图1 八臂迷宫方法检测小鼠的认知功能：假手术组(Sham组)、空白对照组(Vehicle组)及FTY720干预组(FTY720组)，n=8；A.小鼠在吃完8个臂食物前重复访问相同臂次数，FTY720干预组与空白对照组(Vehicle组)相比P<0.001；B.小鼠前8次访问不同臂的个数，组间差异P>0.05；C.小鼠完成固定臂内食物时所犯的错误，即参考记忆错误，组间差异P>0.05

图2 给予FTY720对BCAS术后不同白质区域 LFB 髓鞘染色结果的影响：胼胝体中央区(CCm)、新纹状体(CPu)、前联合(AC)、内囊(IC)、海马伞端(F)等位置在Sham组、Vehicle组、FTY720组LFB染色结果， Vehicle组与Sham组相比*P<0.05,**P<0.01;FTY720干预组与Vehicle组相比#P<0.05，##P<0.01，n=6

图3 给予FTY720对BCAS术后不同时间点对小胶质细胞的影响：Iba1，CD68，DAPI共染示意图，Scale bar,50 μm；Vehicle组与Sham组相比**P<0.01;FTY720干预组与Vehicle组相比#P<0.05，##P<0.01，n=6

3 讨 论

随着当今社会老龄化的不断加剧，与年龄相关的缺血性脑白质损伤疾病的发病率不断增高。人脑白质约占全脑体积的50%，脑白质损伤是多种疾病的重要病理过程，如卒中、血管性痴呆、多发性硬化等，而慢性低灌注引起的脑白质损伤尤为常见[8,9]。因此，要研究缺血性脑白质损伤需要建立一个可靠的慢性低灌注模型。本研究采用低灌注导致的白质损伤模型-小鼠双侧颈总动脉狭窄(BCAS)模型，主要在于这种造模模型更加温和持久的降低脑血流，更好的模拟低灌注白质损伤。

芬戈莫德(FTY720)是一种S1P受体激动剂，是治疗多发性硬化的一线药物[4]。Kwon KJ等的研究发现神经炎症是慢性低灌注白质损伤的动物模型中的关键病理过程[10]。在Meray Serdar等的研究表明FTY720通过减少炎症和氧化应激，以及促进少突胶质前体细胞生长、成熟而改善高氧暴露后新生儿的脑白质结构损伤及认知功能重建[11]。由此我们推测，FTY720可能对低灌注引起的缺血性脑白质损伤有保护作用，且这种作用机制可能与抑制神经炎性有关。

Foster CA等的研究发现在大鼠EAE模型中注射0.3 mg/kg的FTY720可以在脑脊液中检测到高浓度的FTY720P[12]，表明FTY720可以通过血脑屏障，直接影响中枢神经系统。因此，本研究在BCAS术后，给予小鼠腹腔注射0.3 mg/kg FTY720，每日一次，连续注射一个月来观察FTY720对于低灌注脑白质损伤的影响和作用。

大量研究发现，缺血性脑白质损伤以胶质细胞增生及髓鞘不同程度脱失为基本特点[8,13]。前额叶-皮质下环路或与工作记忆相关，BCAS模型降低脑白质区供血，促使白质区轴突-髓鞘完整性受损害，从而使前额叶-皮质下环路与深部白质长联系纤维等环路受损，信息传递发生障碍，导致工作记忆错误增多[14]。我们的LFB髓鞘染色结果显示FTY720治疗组小鼠可以减轻BCAS组小鼠在侧脑室旁的胼胝体中央区(CCm)、新纹状体(CPu)、前联合(AC)和内囊(IC)等区域中白质纤维束中的髓鞘脱失、白质纤维排列紊乱、空泡形成等白质损伤，且在胼胝体中央区最明显。以上实验结果证实FTY720在小鼠低灌注损伤后可以减轻BCAS造模造成的白质区的髓鞘损伤，保持髓鞘结构的完整性。而八臂迷宫结果显示FTY720治疗可以显著减少慢性低灌注造成的工作记忆错误，减轻小鼠短时记忆受损。

小胶质细胞是中枢神经系统中定居的巨噬细胞，是对抗损伤的第一道防线[15]。小胶质细胞在中枢神经系统中调节免疫和炎症反应，在病理情况下，小胶质细胞分泌各种炎症因子，释放毒素，促使脑白质损伤[10,15]。我们的研究结果表明FTY720可以抑制低灌注后小胶质细胞的活化，减轻神经炎症反应，对脑白质损害有保护作用，具有广阔的临床实用前景。