鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定与生物学特性研究

任晓梅，王小兰，韩文龙，张雪梅,2，陈宗超，李 涛，丁 铲，于圣青

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2. 安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一种以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎为主要临床特征的急性、败血性、接触性传染病，部分慢性感染会伴随出现神经症状和生长障碍。RA可感染鹅、鸭、火鸡、天鹅等[1,2]，在自然状态下家鸭最易感。自1904年Riemer首次报道了此病，随后世界各国相继出现了本病的报道，我国自郭玉璞等[3]在北京郊区鸭场首次分离到血清1型RA，现已成为危害养鸭业重大细菌性传染病之一。

近几年的研究发现，我国RA感染呈现发病率和死亡率均上升的趋势[4,5]。目前，鸭疫里默氏杆菌病的防治大多依靠药物，而抗生素的滥用导致大量耐药菌株的出现和动物体内的药物残留，因此，疫苗免疫是控制本病发生与传播最有效的手段。本研究旨在通过对广东省、山东省和江苏省地区疑似患鸭疫里默氏杆菌病的动物病料进行分离鉴定，测定其血清型和耐药情况，为鸭疫里默氏杆菌病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及实验动物 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）购自BD公司，胎牛血清购自Gibco公司，2×Taq PCR Master Mix 购自北京康润科技有限公司；DNA Marker （DL2000）购自TaKaRa公司；细菌生化微量鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司；1日龄健康非免疫樱桃谷鸭和麻鸭，购自无锡某种鸭场，自由采食，笼养至18日龄用于细菌毒力测定。

1.2 细菌分离与培养 无菌条件下，取经临床观察和病理剖检可疑感染RA病鸭的心脏、肝脏和脑组织，分别接种于含2%胎牛血清胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基、普通琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24～48 h，观察细菌的生长情况和菌落特征。选取可疑单菌落经TSA培养基进一步纯化后，用TSB进行增菌培养。

1.3 生化鉴定 取TSA培养基上纯化的单个菌落分别接种于微量生化发酵管，具体操作步骤参考生化反应管说明书进行，观察和记录结果。

1.4 PCR鉴定 按照本实验室建立的RA三重PCR方法，对临床分离株进行保守基因16S rRNA、ompA和groEL的扩增。根据生化试验和三重PCR鉴定结果，将RA阳性分离株转接于TSA平板培养至对数生长期后冷冻保存。

1.5 血清学鉴定 将各RA分离株菌液用灭菌PBS稀释至5×109CFU/mL，取5 μL抗原分别与等体积的血清1型、2型、10型和15型RA单特异性血清进行玻片凝集试验，观察记录结果。

1.6 药物敏感性试验 采用纸片琼脂扩散法（K-B法）对RA分离株进行药物敏感性检测，参照美国临床实验室标准化委员会NCCLS标准判断结果。

1.7 动物回归致病性试验 选取鉴定后冻存的12株RA分离株分别接种于TSA平板并传代培养，取第3代新鲜菌体经无菌PBS洗涤2次后，稀释菌液至含菌量为2.0×108CFU/mL，腿部肌肉注射18日龄的樱桃谷鸭或麻鸭，0.5 mL/羽，每组3只，于攻毒后观察动物发病、死亡情况。

2 结果

2.1 鸭疫里默氏杆菌的分离、鉴定及血清型检测 从临床病料中共分离出46株RA，分离株在普通琼脂、麦康凯琼脂培养基上不生长，在TSA培养基上可生长圆形、微突起、表面光滑的奶油状小菌落。革兰氏染色镜检可见革兰阴性短杆菌，多数呈单个状态，少数成对或短链排列。生化试验结果显示：46株RA分离株均不发酵乳糖和半乳糖，部分菌株可发酵葡萄糖（26株）和蔗糖（9株）；甲基红试验、VP试验、硫化氢产生、硝酸盐还原和枸橼酸盐试验均为阴性；31株分离株可液化明胶，32株分离株可分解尿素；46株RA分离株氧化酶、触酶试验均为阳性。采用三重PCR方法对46株RA分离株进一步鉴定，所有待检菌株均可扩增出RA 16S rRNA、ompA和groEL基因片段，与预期大小一致。采用玻片凝集法对46株RA分离株进行血清学鉴定，其中，血清1型菌株9株，血清2型菌株25株，血清10型和15型菌株各1株，与标准血清1型、2型、10型和15型抗体均不发生凝集反应的分离株10株，暂定为未定血清型菌株，表明血清2型为RA新临床分离株的优势血清型（表1）。

表1 RA临床分离株的分离与鉴定Table 1 Isolation and identification of the RA isolates

2.2 分离株的药敏试验 结果显示，RA临床分离株呈现广谱的耐药性，普遍对林可霉素、多粘菌素、诺氟沙星耐药，多数对新霉素（89.1%）、红霉素（89.1%）、链霉素（89.1%）和氨苄西林（80.4%）耐药，仅对氟苯尼考和头孢唑肟有较强的敏感性，适合临床使用。并且，RA分离株的耐药情况呈现一定的区域性差异：青霉素类，河南省、广东省、山东省地区的RA分离株普遍耐药，而江苏省地区的分离株则敏感；大观霉素和多西环素，广东省和江苏省地区的RA分离株普遍敏感。

2.3 动物回归试验 RA分离株以1×108CFU/羽感染18日龄樱桃谷鸭或麻鸭，感染的樱桃谷鸭于24 h开始出现精神委顿，食欲废绝，行动不便等症状；48 h后部分毒株感染鸭出现死亡；第96 h达到死亡高峰期。剖检可见胸腔积液，心包增大变厚，出现明显的纤维素样渗出，与胸腔内膜粘连；肝脏表面包裹着一层淡黄色的纤维素样薄膜，边缘钝圆；脾脏出现大理石样花纹（图1A）。RA分离株感染麻鸭后，48 h开始出现临床症状，72 h出现死亡。剖检可见典型的纤维素性心包炎和脾肿大呈大理石样（图1B）。对照组樱桃谷鸭和麻鸭食欲、精神状态均正常。各组试验鸭感染RA分离株均不同程度地发病，结果见表3。

表2 RA分离株对抗菌药物的耐药情况Table 2 Susceptibility of isolates to antibiotics

图1 RA分离株感染樱桃谷鸭（A）和麻鸭（B）病理剖解图Fig.1 Clinical pathological features of cherry valley ducks(A) and sheldrake (B) infected with RA isolates

3 讨论

本研究对广东省、山东省、江苏省地区的病死鸭分离到的可疑RA菌株进行了鉴定、血清型分型以及药敏试验、动物回归试验。研究结果表明，共鉴定到46株RA菌株，血清型分布主要集中在1型和2型，同时也包含其他血清型。本研究分离到的RA菌株能感染樱桃谷鸭和麻鸭出现典型的临床症状及病理变化，且樱桃谷鸭感染后病理变化较麻鸭强，与送检鸭临床病理特征一致。

表3 RA分离株的动物回归试验结果Table 3 Determination of the bacterial virulence to ducklings

鸭疫里默氏杆菌血清型众多，国际上已报道了21种血清型[6-8]。而我国关于鸭疫里默氏杆菌血清型的报道：1997年前仅发现血清1型RA；1997年后，苏敬良等[9]、张大丙等[10]从北京不同鸭场分离到2、6、10、11、13、14型和其他未知血清型RA菌株。2002年程安春对分离到的1842株RA进行分型，发现1型、2型为优势血清型，同时还发现了3、4、5、8血清型分布；2007年张小峰等[11]对珠三角地区分离到的RA进行血清型鉴定发现，血清1型为优势血清型。本研究结果显示血清2型是山东省、广东省、江苏省地区鸭疫里默氏杆菌的优势血清型。由于RA各血清型间不存在交叉保护，临床上选用对应血清型的疫苗是本病防控的关键。

目前，鸭疫里默氏杆菌的耐药现象越来越严重，部分地区的鸭疫里默氏杆菌多重耐药现象也越来越普遍。本研究对46株RA分离株的药物敏感性进行分析发现，分离株对常见的抗菌素均有不同程度的耐药。可能的原因是RA中存在天然耐药基因，2007年蔡秀磊等[12]检测了来自浙江的22株RA发现全部含有介导细菌耐药的Ⅰ型整合子系统，可介导对氨基糖苷类、氯霉素耐药基因，随后Zheng等[13]也报道了在47株鸭疫里默氏杆菌中46株存在Ⅰ型整合子系统；更为重要的原因是抗生素的滥用，饲料中任意添加，出现疫病随意加大剂量，使RA对原本敏感的抗生素逐渐变得耐药，早期报道90%以上的鸭疫里默氏杆菌对红霉素、青霉素、新霉素等高度敏感[14]，而本研究结果显示RA对以前敏感的抗生素均出现了不同程度的耐药，抗菌谱逐渐扩大。科学用药，合理用药才能避免耐药的产生，为疫病防控打好基础。