非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9敲除技术研究进展

任 名，郭晓宇，邬 静，李金祥，朱鸿飞，陈鸿军

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.湖南农业大学动物医学院，长沙410128；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）

非洲猪瘟（african swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，发病率高，死亡率可高达100%，一经确诊必须全部扑杀。世界动物卫生组织（Office international des é pizooties，OIE）将ASF列为必须报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，是重点防控的外来病。2018年8月3日，中国辽宁省沈阳市确诊中国首例非洲猪瘟疫情，疫点内913头生猪已经全部扑杀和无害化，消毒工作全面展开[1]。虽然国内在此之前无非洲猪瘟疫病例报告，但相关防控以及疫苗研制工作一直在推进。研究人员在免疫佐剂、弱毒疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗（P72、P30、P54、P12）方面已进行了大量的工作[2]，但遗憾的是，临床试验结果显示这些疫苗均不能提供良好的保护效率。近期研究发现通过建立非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9基因敲除操作技术平台，将为非洲猪瘟病毒基因功能研究和毒力基因缺失的新型弱毒疫苗研究提供便捷的工具。

1 传统ASFV疫苗研究进展

目前国内外已经研制出了ASFV灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、同源重组弱毒疫苗以及其他新型疫苗，但这几种疫苗都存在不同程度的局限性[3]。

1.1 灭活疫苗 灭活疫苗是最经典最早期的疫苗研制方式。非洲猪瘟病毒刚被发现时，研究人员就已开始研制灭活疫苗。然而，至今为止，使用或不使用佐剂都不能诱导机体产生有效保护性反应，经加热、复方碘溶液、甲苯、福尔马林、结晶紫、β-丙内酯、乙酰氮丙啶和缩水甘油醛处理的ASFV灭活疫苗虽部分能刺激猪产生抗体，但即使借助佐剂仍无法抵御ASFV的攻击[3]。

1.2 亚单位疫苗 亚单位疫苗的研究策略主要是将具有中和表位的ASFV保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，然后将产生的蛋白质或多肽递呈给抗原递呈细胞，以诱导产生高滴度的抗ASFV中和抗体。ASFV编码的结构蛋白有很多。恢复期猪血清抗体检测显示P72、P30和P54为感染过程中引起体液免疫应答最重要的3个抗原蛋白[4-9]。针对P72和P54的抗体可以阻止病毒吸附，针对P30的抗体可以阻止病毒内吞[7]。但目前研究结果显示，将这3个蛋白质作为ASF亚单位疫苗仅可提供部分保护或没有保护[10,11]。

1.3 DNA疫苗 DNA疫苗又称核酸疫苗。作为新一代的疫苗研制方向，ASFV的相关研究工作也已经在开展。Argilaguet等[12]利用真核表达质粒pCMV-PQ表达P30和P54，结果显示，该DNA疫苗免疫猪后无法抵御强毒株的攻击。随后，该实验室又进一步将ASFV血凝素蛋白基因和泛素基因（ubiquitin）连入上述DNA疫苗中，结果仍不能达到完全保护的功效[13]。

1.4 同源重组弱毒疫苗 弱毒疫苗通常能赋予机体针对同源病毒的相对保护力，但针对异源病毒的保护力弱甚至没有保护力，同时弱毒疫苗还存在造成潜伏感染和毒力返强的可能性。对于弱毒疫苗的研制，同源重组一直是ASFV基因缺失的主导技术。但该方法的同源效率非常低，且需要经过多轮纯化才能去除野生型病毒。目前科学家们已利用同源重组技术成功构建了多种基因敲除的ASFV，具体研究进展见文献[14]，在此不再赘述。重组致弱疫苗不仅可以提供良好的免疫保护，而且由于复制缺陷的特点，将显著降低疫苗毒株返强可能性和毒副作用。然而，由于大部分单一基因缺失毒株的毒力仍难以稳定致弱，这类疫苗的动物实验仍停留在实验室阶段，至今很难应用于临床免疫防控[15]。

1.5 细菌染色体组技术（bacterial artificial chromosome，BAC） 由于ASFV的病毒DNA两端存在可变区，基因组DNA末端交叉连接成环形，病毒粒子含依赖于DNA的RNA多聚酶，而该聚合酶的亚基种类至今尚未全面了解[16]，因此，至今难以在该病毒中使用细菌染色体组技术。

2 CRISPR/Cas9敲除技术在ASFV疫苗研究中的应用

2.1 CRISPR/Cas9敲除技术 CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motifs, PAM）结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单（5'-NGG-3'），几乎可以在所有基因中找到大量靶点。迄今为止，CRISPR/Cas9系统已广泛用于动、植物和微生物的基因组改造。科研人员已经使用CRISPR系统编辑了多种病毒，例如I型单纯疱疹病毒[17]，Epstein-Barr病毒[18]，伪狂犬病毒[19]和牛痘病毒[20]等。2018年，CRISPR/Cas9系统已开始用于非洲猪瘟病毒的基因组改造，且敲除效率得到显著提升[22]。

2.2 CRISPR可以高效构建重组ASFV并易于重组病毒的纯化 ASFV对稳定细胞系适应后，会引起病毒基因组的大部分区域自发缺失，导致病毒毒力严重致弱，丧失对同源亲本毒株攻击的保护能力。因此，为了保持病毒基因组的稳定性，必须在猪巨噬细胞的原代细胞培养物中产生重组ASFV。重组ASFV的构建通常依靠通过靶向基因的两侧向ASFV导入含有同源重组臂的质粒，并用质粒中的报告基因取代靶向基因。这种同源重组方法，尤其是在猪巨噬细胞培养中进行的同源重组方案，重组效率非常低，野生病毒背景高，难以纯化重组ASFV，需要进行多轮空斑纯化或有限稀释[21,22]。

2018年，Borca等[23]CRISPR/Cas9诱导Cas9双链断裂ASFV基因组中8-DR的开放阅读框（open reading flame，ORF），在猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAM）中从Georgia07毒株的基因组中删除非必需基因8-DR，并用红色荧光蛋白（red fluorecent protein，RFP）基因替代[24]。敲入质粒中包含左臂8-DR ORF上游区域（72 169 bp～73 369 bp）和右臂8-DR ORF的下游区域（74 454 bp～75 653 bp），插入片段为RFP和Blasticidin基因（图1）。设计相关gRNAs，克隆入pCAS-Guide载体（来自Blue Heron Biotech公司）中。随后，在感染野生病毒的PAM细胞中，将两种8DR靶向gRNAs载体与敲入载体共转染，使用CRISPR/Cas9系统后，在转染后24 h，检测到约4log10TCID50的重组ASFV。与传统的同源重组技术相比，通过CRISPR/Cas9获得的重组病毒低于滴定检测限（＜0.5Log10TCID50），但通过细胞盲传，可以检测到荧光表达，获得重组病毒。结果表明该方法有效构建了ASFV重组病毒，通过对比试验发现，使用CRISPR/Cas9相对于同源重组方法，能够显著提升重组效率，并易于重组病毒的纯化。因此，使用CRISPR技术编辑ASFV基因组已经成为可能[23]。

采用有限稀释法对CRISPR/Cas9敲除的ASFV Georgia病毒进行纯化，利用感染后荧光细胞来监测纯化。结果发现，使用CRISPR/Cas9系统明显增加重组病毒重组效率，比使用传统同源重组方法的纯化过程更容易，仅经过5次有限稀释，即可获得纯化子，这比使用传统的同源重组方法纯化ASFV所需的时间缩短很多[24-26]。

图1 ASFV重组位点设计Fig. 1 ASFV recombination site design

2.3 pX330-ΔNLS1/ 2neoR载体构建以及稳定表达gRNA野猪肺细胞系建立

2.3.1 pX330-ΔNLS1/ 2neoR载体构建 为了鉴定和克隆ASFV基因组中合适的CRISPR/Cas9靶序列，需要构建合适的载体。有研究人员使用载体质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas920[27]。该载体质粒最初被设计用于编辑哺乳动物基因组，在Cas9 ORF的两端编码核定位信号（nuclear localization signal, NLS）。由于ASFV主要在受感染细胞的细胞质中复制，因此需去除Cas9的NLS[28]。在去除两端NLS之后，插入新霉素抗性基因，从而构建获得pX330-ΔNLS1/2neoR载体。NLS-less Cas9载体已被成功应用于痘苗病毒的定向突变[29]。

2.3.2 稳定表达gRNA的野猪肺细胞系（wild boar lung cell line, WSL）建立 靶向P72和核酸酶的gRNA序列插入至pX330-ΔNLS1/2neoR载体中，将质粒分别转染野猪肺细胞系（WSL），新霉素抗性筛选细胞，通过Western blot、PCR和基因组DNA测序检测Cas9表达。结果表明，特异性gRNA在多次（＞50）传代中稳定表达，且未发生Cas9核酸酶的脱靶反应[30]。在WSL中，ASFV复制明显受到抑制。CRISPR/Cas9系统还有助于从病毒基因组中特异性地删除CP204L（P30）和其他必需的或非必需的ASFV基因。必需基因敲除时，为了避免病毒不能复制，可以通过共转染基因表达质粒的互补实验来弥补。该策略不仅有助于阐明病毒基因功能，也适合作为减毒或单循环活疫苗。

3 展望

随着首例非洲猪瘟在国内发生，养猪业将受到巨大的威胁，非洲猪瘟的基础致病性研究和储备性疫苗的研究工作已经迫在眉睫。而CRISPR也许就是打开ASFV疫苗研制这扇门的一把钥匙，CRISPR技术的应用为非洲猪瘟病毒的基础致病性研究带来了曙光，也为研制非洲猪瘟基因缺失活疫苗提供了新的研究思路，更多ASFV基因的敲除研究工作正在进行之中。