肝靶向肽-抗肿瘤肽CSP-MDA-7/IL-24融合基因原核表达条件优化

陈瑜丽，张晶晶，马艳，卢雪梅，刘文彬 ，金小宝 ，汪洁

1.广东药科大学 基础学院 药用生物活性物质研究所，广东 广州 510006；2.广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州 510006；3.广东药科大学 生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006

肝靶向肽CSP I-plus是从疟原虫环子孢子蛋白（circumsprozoite protein，CSP）中筛选得到的能够特异识别并黏附在肝细胞表面的多肽序列。肝靶向肽能与肝细胞表面受体硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）特异性结合，将具有药物活性的物质富集于肝脏部位，发挥其生物学功能[1-2]。黑色素瘤分化相关基因 7（melanoma differentiation-associated gene-7，MDA-7）是Fisher等[3-4]于1995年发现的具有细胞因子样特性的肿瘤抑制基因，其编码的蛋白具有广谱抗肿瘤活性，有强大的“肿瘤特异性旁观者效应”，可对周围甚至远处转移的肿瘤细胞产生凋亡诱导效应，对控制肿瘤复发具有重要的临床意义，但对正常细胞无任何毒性[5-9]。后来发现MDA-7与白细胞介素10（IL-10）细胞因子家族基因具有同源性和亲缘关系，属于IL-10家族，因此，2001年被重新命名为白细胞介素24（IL-24）。研究表明，MDA-7/IL-24在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织，其表达水平与肿瘤大小、病理分级和血清甲胎蛋白（AFP）呈明显的负相关，且随着肝癌恶性程度的增加表达水平减少或缺失[10]。基于肝靶向和抗肿瘤的双重作用，本实验室利用基因工程技术构建了肝靶向肽-抗肿瘤肽（CSP-MDA-7/IL-24）融合基因，期望用于肝癌术后治疗，减少术后复发率和提高生存率。如何获得大量重组蛋白CSP-MDA-7/IL-24以满足其开发应用和研究须进一步探索。我们对诱导时间、培养基pH值、诱导温度和诱导剂IPTG浓度各选取5个水平进行正交试验，对重组蛋白进行条件优化，为重组蛋白CSP-MDA-7/IL-24的规模化生产和活性评价奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

重组大肠杆菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24由广东省生物活性药物研究重点实验室保存；大肠杆菌表达载体pET21b及大肠杆菌BL21由本实验室保存。丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、TEMED（BioRad公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid公司）；异丙基-β-D-硫代半糖（IPTG）（Sigma公司）；氨苄青霉素（Amp）（Amresco公司）；蛋白预染marker（Fermentas公司）。

1.2 重组大肠杆菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24的构建

将CSP-MDA-7/IL-24融合基因的PCR产物纯化后，分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切重组克隆载体CSP-MDA-7/IL-24和质粒表达载体pET21b，用T4DNA连接酶将克隆载体双酶切得到的小片段与质粒pET21b连接构建重组表达载体pET21b-CSP-MDA-7/IL-24，经鉴定为阳性后转化大肠杆菌DH5α感受态，转化菌种涂于含Amp的LB固体培养基上，37℃恒温箱培养16～18 h，获得重组大肠杆菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24。

1.3 生长曲线测定

接菌环取一环重组菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24甘油种子划在LB平板上，37℃过夜培养后挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃、180 r/min培养过夜，按体积比 1∶100接入LB培养基中扩大培养，此时开始计时，分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8和 9 h各取1 mL菌液测定D600nm值，以时间为横坐标、D600nm值为纵坐标，绘制表达菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24的生长曲线，以研究其生长规律，确定最佳诱导时机。

1.4 单因素分析诱导表达条件

1.4.1 诱导时间对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响 将培养过夜的重组菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24菌液加到 300 mL 含 100 μg/mL Amp的LB培养基中，体积比为1∶100，37℃摇床培养2.5 h至D600nm值为0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，于37℃摇床中振荡培养，分别于0、1、2、3、4、5、6、7和8 h取样，4℃、12 000 r/min离心5 min收集各样品中的菌体，分别加入160 μL 1×Tris-HCl和 40 μL 5×SDS 上样缓冲液，充分混匀后沸水浴10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清进行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝胶成像系统分析各样品中重组蛋白占总蛋白的百分含量，确定重组菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24蛋白表达的最佳诱导时间。

1.4.2 培养基pH值对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响 将培养过夜的重组菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24按体积比1∶100加到pH值分别为4、5、6、7、8、9和10的含100 μg/mL Amp的LB培养基中，37℃振荡培养2.5 h至D600nm值为0.6时，分别加入终浓度为1.0 mmol/L的诱导剂IPTG，振荡培养4 h，取样进行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝胶成像系统分析各样品中重组蛋白占总蛋白的百分含量，确定重组菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24蛋白表达的最佳培养pH值范围。

1.4.3 诱导温度对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响 将培养过夜的重组菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24按体积比1∶100分别加到含100 μg/mL Amp的LB培养基中，37℃振荡培养2.5 h至D600nm值为0.6时，分别加入终浓度为1.0 mmol/L的诱导剂IPTG，分别于17、22、27、32、37、42℃振荡培养4 h，取样进行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝胶成像系统分析各样品中重组蛋白占总蛋白的百分含量，确定BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌蛋白表达的最佳诱导温度。

1.4.4 诱导剂IPTG浓度对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响 将培养过夜的重组菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24按体积比1∶100分别加到含100 μg/mL Amp的 LB培养基中，37℃振荡培养2.5 h至D600nm值为0.6时，分别加入诱导剂IPTG至终浓度为 0.00、0.03、0.06、0.12、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L，37℃振荡培养 4 h，取样进行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝胶成像系统分析各样品中重组蛋白占总蛋白的百分含量，确定BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌蛋白表达的最佳诱导剂IPTG浓度。

1.5 正交设计优化诱导表达条件

根据单因素分析结果，用正交设计助手V3.1设计正交试验L25（45），以不同诱导时间（2、3、4、5、6 h）、不同培养基pH值（6、6.5、7、7.5、8）、不同诱导温度（32、34.5、37、39.5、42℃）和不同诱导剂IPTG 浓度（0.03、0.06、0.12、0.25、0.50 mmol/L）四因素五水平进行表达优化，研究BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌高水平表达的规律。

2 结果

2.1 BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24重组菌株的生长曲线分析

生长曲线反映了工程菌的生长变化趋势，可以确定该重组菌株在某一时刻所处的生长阶段，依此为依据，选择合适的诱导条件进行诱导。由BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24重组菌株的生长曲线（图1）可见，培养2～3 h时菌株处于对数生长期。

图1 重组菌株BL21/p ET21b-CSP-MDA-7/IL-24的生长曲线

2.2 单因素分析诱导表达条件

2.2.1 诱导时间对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响 首先考察了不同诱导时间对CSP-MDA-7/IL-24融合基因表达的影响。结果见图2，随着诱导时间的增加，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表达量也在逐渐增加，在加入IPTG诱导4 h后，重组蛋白表达量达到高峰，占菌体总蛋白的49.5%。但随着诱导时间的增加，杂蛋白也在不断增加，所以4 h为诱导最佳时间。

图2 不同诱导时间重组菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24表达蛋白的SDS-PAGE

2.2.2 培养基pH值对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响 对培养基不同pH值的考察结果见图3，在其他诱导条件相同的情况下，培养基pH值为6～8时适宜CSP-MDA-7/IL-24表达，pH值为7.0时目的蛋白表达达高峰，占菌体总蛋白的89.6%。

图3 培养基不同pH值时重组菌

2.2.3 诱导温度对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响 诱导温度对CSP-MDA-7/IL-24重组蛋白的表达有很大影响。如图4所示，在其他诱导条件相同的情况下，培养温度为42℃时，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表达含量占菌体总蛋白的54%，均高于其他温度。

图4 不同诱导温度时重组菌

2.2.4 诱导剂IPTG浓度对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响 诱导剂IPTG通过诱导pET原核表达载体中的lacUV5启动子来过量表达T7RNA聚合酶，从而增加目的蛋白的表达。IPTG浓度对CSP-MDA-7/IL-24蛋白表达的影响如图5所示，在其他诱导条件相同的情况下，IPTG浓度为0.12 mmol/L时，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表达含量占菌体总蛋白的25.2%。

图5 不同IPTG浓度时重组菌

2.3 正交试验优化表达条件

正交设计是一种快速、高效、经济，能够研究多因素不同水平的试验设计方法。通过正交试验分析影响重组菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24表达外源蛋白的主要因素，能够提高目的蛋白的表达量。通过正交试验L25（45）对诱导时间、培养基pH值、诱导温度和诱导剂IPTG浓度共四因素五水平进行优化（参数水平见表1）。图6为正交试验不同条件下目的蛋白的表达结果，正交分析软件分析四因素五水平对蛋白表达量的影响如表2（正交试验结果与分析）、表3（方差分析）。结果表明，诱导温度是CSP-MDA-7/IL-24表达的主要影响因素，具有显著性差异；诱导时间、培养基pH值和诱导剂IPTG浓度对蛋白表达的影响较小，无显著差异。综合分析，42℃诱导4 h，培养基pH值为7.0，IPTG浓度为0.12 mmol/L，是CSP-MDA-7/IL-24蛋白表达的最佳条件。背景清楚等优点的原核表达系统进行表达[11-13]。原核系统表达时，不同诱导条件在很大程度上影响目的蛋白的表达量[14-17]。本实验中，融合基因CSP-MDA-7/IL-24在大肠杆菌BL21/pET21b表达

表1 正交实验选取因素及其水平

图6 SDS-PAGE分析正交试验各条件下目的蛋白的表达量

表2 正交试验结果

表3 正交试验软件方差分析各因素对目的蛋白表达量的影响

3 讨论

蛋白质药物凭借其活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确和有利于临床应用等特点，已经成为医药领域的重要组成部分。重组蛋白可通过原核表达系统、昆虫表达系统和酵母系统等进行表达。在本实验中，我们利用DNA重组技术构建融合基因CSP-MDA-7/IL-24，选取具有易于培养、繁殖快、表达量高、成本低、易纯化和遗传载体中被诱导表达，蛋白产物以包涵体的形式存在，有利于目的蛋白的进一步提纯。

研究表明，细菌生长速率对外源蛋白表达有很大影响。为提高目的蛋白表达效率，我们通过测定重组菌株的生长曲线，确定最佳诱导时机。单因素分析确定最适培养基pH值、最佳诱导温度、最佳诱导时间和最适诱导剂IPTG浓度，并在此基础上各选取5个水平进行正交试验，摸索出最佳诱导表达条件。单因素分析结果表明，在最佳诱导时机，随着诱导时间不断增加，目的蛋白表达量也在不断增加，诱导4 h时达到浓度高峰。在相同诱导时间下，SDS-PAGE结果分析表明，培养基pH为7.0、诱导温度42℃、不同IPTG浓度下表达量相当。正交试验SDS-PAGE结果表明，CSP-MDA-7/IL-24重组蛋白的表达最佳条件组合为诱导4 h、pH7.0、诱导温度42℃、IPTG浓度0.12 mmol/L，此时目的蛋白表达量最高，达43.6%。正交分析结果表明，四因素五水平中，诱导温度对重组蛋白表达具有显著性影响，而pH值、温度和IPTG浓度则无明显影响。

本研究确定了重组蛋白肝靶向肽-抗肿瘤肽的最佳表达条件，为深入探讨其复性条件、纯化条件、生物学活性及药物开发等提供了更多实验依据。