逆转录病毒介导的稳定表达E4orf1和绿色荧光蛋白的胎肝窦内皮细胞株的建立

李慧琳，谢小燕，王思涵，韩毅，范增，白云，何丽娟，南雪，裴海云3,，岳文，裴雪涛,

1.南方医科大学 检验与生物技术学院，广东 广州 510515；2.军事科学院 军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所军事再生医学研究室，北京 100850；3.军事科学院 军事医学研究院 辐射医学研究所实验血液学与生物化学研究室，北京 100850；4.华南生物医药研究院 华南干细胞与再生医学研究中心，广东 广州 510005

造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）具有高度自我更新能力及多向分化潜能，可以产生所有类型的血液细胞，如红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞等[1]。它在生命过程中不仅能够重建整个造血系统，还具备维持长期造血的功能。近年来，HSCs移植越来越多地用于临床治疗血液或非血液系统的恶性肿瘤，显示出广阔前景[2]。其中，尤以脐带血移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）备受青睐，它具有来源广泛、易于采集、对供体无伤害、HLA配型要求低、移植后复发率及移植物抗宿主病（graft-versushost disease，GVHD）发病率较低等优点。然而单份脐带血中HSCs绝对数量较少，输注后易导致中性粒细胞恢复延迟并增加细菌及病毒感染的风险[3]，而双份脐带血移植则会带来GVHD发病率增加、血小板恢复时间延长等一系列问题[4]。综合来看，对HSCs进行体外扩增培养是最直接便捷的解决方法，但迄今构建适宜的HSCs体外扩增微环境仍是亟待解决的瓶颈问题。

造血微环境由临近HSCs的多种支持细胞构成，包含成骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞、基质细胞和免疫细胞等[5]，其中内皮细胞与HSCs拥有共祖细胞生血内皮、共表达许多表面标志和转录因子如CD34、CD31、Runx1、GATA-2等，而且可以通过分泌多种因子影响HSCs的增殖和自我更新，成为造血微环境的核心组分[6]。在以内皮细胞为支持细胞培养HSCs的研究中，有报道表明血清和促血管生成因子可以抑制内皮细胞的自分泌对造血稳态的维持作用。为保留内皮细胞特性并为与HSCs的共培养提供基本条件，Seandel等将腺病毒E4区开放读框1（E4orf1）的基因转入原代脐静脉内皮细胞，通过活化Akt，使其获得永生能力且可以维持内皮自身特性，成为研究血管微环境的适宜模型[7]。

在胚胎发育中，肝脏是一个重要的造血器官，也是HSCs自我更新与扩增最旺盛的场所，其中的胎肝窦内皮细胞（human fetal liver sinusoid endothelial cells，HFLSECs）是一类结构独特的血窦内皮，约占肝非实质细胞总数的70%，具有吞噬、抗原提呈、血流调节等功能[8]，可以分泌内皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子（TNF）等多种细胞因子，还参与髓外造血以及HSCs在肝小叶区的选择性植入[9]。这提示我们，这类肝脏所特有的内皮细胞有可能是影响HSCs维持与自我更新的重要微环境因素。在本研究中，我们利用逆转录病毒载体系统建立了稳定表达E4orf1和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的 HFLSECs（E4orf1-GFP/HFLSECs），期望以该转基因的内皮细胞作为饲养层，构建促进HSCs体外扩增的新培养体系，也为多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程获得HSCs提供维持增殖与自我更新的微环境。

1 材料与方法

1.1 材料

HFLSECs购自Pricells公司；脐带血由海军总医院和北京中西医结合医院妇产科提供；感受态大肠杆菌DH5α购自康为世纪公司；质粒MSCVN E4orf1购自Addgene公司；携带GFP基因的逆转录病毒载体pMX-GFP为美国Hiroyuki Hirai教授惠赠。

LipofectAMINE 2000和Opti-MEM培养基购自Invitrogen公司；多聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）、明胶、牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma公司；高糖DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA购自Gibco公司；EGM-2 Bullet kit购自Lonza公司；杀稻瘟菌素（blasticidin）、嘌呤霉素（puromycin）购自Invivogen公司；聚凝胺（polybrene）购 自 Millipore公 司 ；CD144-PE、KDR、CD133-PE、CD45-APC抗人单克隆抗体购自BD公司；CD117-APC、CD31-APC抗人单克隆抗体购自Ebioscience公司；兔抗人假性血管血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）单克隆抗体购自Sino Biological公司；羊抗兔荧光二抗购自中杉金桥公司；质粒提取试剂盒购自Axygen、QIAGEN公司；红细胞沉降液、人外周血淋巴细胞分离液购自TBD公司；CD34分选磁珠购自美天旎公司；StemSpan培养基、造血集落培养基MethoCult H4434购自Stemcell公司；干细胞因子（stem cell factor，SCF）、Fms样酪氨酸激酶3配体（Fms-like tyrosine kinase 3 ligand，Flt-3L）、促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）购自Peprotech公司。

1.2 免疫荧光

吸弃培养HFLSECs孔板中的培养上清，用PBS清洗3次后，4%多聚甲醛室温固定细胞20 min，PBS-T（PBS+0.1%吐温20）清洗2次，以PBST（含1%BSA+1%吐温20）室温孵育10 min进行破膜，再用PBS-T清洗3次，每次5 min，用PBS-T（含1%BSA）室温孵育30 min封闭后，加入兔抗人vWF抗体（1∶1000）4℃孵育过夜，次日弃上清，用PBS-T清洗3次，每次5 min，再加入羊抗兔FITC IgG抗体（1∶500）避光室温孵育1 h，弃上清，PBS-T洗3次，每次5 min，最后加入DAPI（1∶500）室温复染细胞核1 min，弃上清，PBS洗3次，每次5 min，将细胞培养板置于Nikon ECLIPSE Ti型倒置荧光显微镜下镜检，拍照。

1.3 质粒转化、提取、酶切鉴定及测序

取50 μL感受态大肠杆菌DH5α加入1～3 μL质粒 MSCV-N E4orf1，冰浴 30 min，42℃热激 60 s，再冰浴5 min；向细菌-DNA复合物中加入500 μL LB培养基，于37℃摇床上300 r/min培养45 min后8000 r/min离心3 min，取20～80 μL菌液涂布于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；次日挑取单个菌落加入5 mL含氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB培养基中，37℃摇床上200 r/min培养16 h，将菌液以1∶200的比例加入500 mL含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB培养基中，37℃摇床上200 r/min培养16 h；用质粒提取试剂盒提取质粒MSCV-N E4orf1，用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定，送Sangon Biotech公司测序。

1.4 嘌呤霉素条件培养杀灭实验

用0.25%胰酶消化 HFLSECs，以1×105/孔接入24孔板培养，16～24 h后替换为分别含0.5、1、2、4 μg/mL嘌呤霉素的EGM-2培养基，最后一孔仍然用不含嘌呤霉素的EGM-2培养基培养，作为对照组，在显微镜下观察细胞存活情况。

1.5 逆转录病毒包装、细胞转染、药物筛选及转染后HFLSECs流式细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）

复苏包装细胞Plat-A，接种至预先包被0.1%明胶的培养瓶中，用 DMEM（含 10%FBS、1 μg/mL杀稻瘟菌素、0.1 μg/mL嘌呤霉素）培养，当细胞生长至70%～80%融合时，用0.25%胰酶消化Plat-A，以5×105/孔接入预先包被PDL的6孔板中用1.5 mL DMEM（含10%FBS）培养，包装所用培养基不含抗生素，24 h后，用LipofectAMINE 2000介导质粒MSCV-N E4orf1和pMX-GFP转染，将5 μg质粒及10 μL脂质体加入500 μL无血清Opti-MEM中，室温静置20 min后，将含有DNA-LipofectAMINE 2000复合物的无血清培养基加入Plat-A中，培养20 h后替换EGM-2培养基1.5 mL/孔，同时复苏HFLSECs，以1×105/孔接入 6 孔板中用EGM-2培养，24 h后收集病毒上清，将用0.45 μm无菌滤膜过滤器过滤后的病毒液（含8～10 μg/mL聚凝胺）直接加入用PBS洗涤1次的HFLSECs中，Plat-A加入EGM-2继续培养24 h，用同样方法收取第二次病毒加入HFLSECs中，培养24 h后换液，1～2 d后加压药筛，之后隔天换液，当细胞培养至90%汇合时用0.25%胰酶消化，收集细胞进行流式分选。

1.6 流式细胞术

培养E4orf1-GFP/HFLSECs至细胞长至80%～90%汇合，PBS洗涤细胞1次，用0.25%胰酶于37℃消化细胞3～5 min，终止消化后收集细胞于15 mL离心管中，室温1000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞后分装于1.5 mL EP管中，每管50～100 μL，分别标记流式抗体，避光4℃旋转孵育 40 min～1 h，用 PBS 洗涤 2 次，用 200 μL PBS重悬细胞，筛网过滤后收集细胞于流式管中，1 h内上BD FACSAria型流式细胞仪进行检测。

1.7 分离人脐带血（umbilical cord blood，UCB）CD34+细胞

将脐带血转入无菌T75细胞培养瓶中，按总体积的三分之一加入红细胞沉降液，充分混匀，自然沉降20～40 min，用滴管收集上层血浆层至50 mL离心管中，室温2000 r/min离心5 min，10 mL PBS洗涤1次，用5 mL PBS重悬细胞；用密度梯度离心法获得单个核细胞（mononuclear cells，MNCs），在15 mL离心管中加入5 mL 外周血淋巴细胞分离液，用滴管将5 mL细胞悬液在分离液液面上方1 cm处沿离心管壁缓慢加至分离液液面之上，将离心管置于水平离心机中，以最低档升降速室温2000 r/min离心20 min，离心后管内细胞悬液分为4层，用滴管吸取灰白色云雾状细胞层置于50 mL离心管中，加入PBS洗涤1次，重悬细胞至1.5 mL EP管中，按照CD34 Microbeads kit说明书加入CD34分选磁珠，4℃避光旋转孵育40 min，PBS洗涤1次，于磁场中进行CD34+细胞分选。

1.8 E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层培养人UCB来源的CD34+细胞

从UCB中分离获得CD34+细胞，以5×104/孔接入E4orf1-GFP/HFLSECs中，以无饲养层的悬浮培养作为对照组，以StemSpan培养基（含SCF、Flt-3L、TPO各50 ng/mL）连续培养15 d，每隔3 d计数有核细胞（nucleated cells，NC）总数，当细胞总数超过1×106时，须将细胞传代至新的饲养层上继续培养。

1.9 集落形成实验

将扩增后的HSPCs以250/孔接种于造血集落培养基MethoCult H4434中连续培养14 d，观察并拍照记录不同集落形成单位（colony forming units，CFU），用血球计数板和台盼蓝染色进行细胞计数。

1.10 数据统计分析

数据以x±s表示，用Excel进行统计分析。

2 结果

2.1 免疫荧光鉴定vWF在HFLSECs中的表达

vWF也称Ⅷ因子相关抗原，是一种由血管内皮细胞合成并分泌的大分子蛋白多聚体，在体内参与血液凝固和血栓形成[10]，常被作为特征因子来鉴定体外培养的内皮细胞。免疫荧光结果（图1）表明，原代培养的HFLSECs的vWF表达阳性。

2.2 质粒MSCV-N E4orf1的酶切鉴定及测序

提取质粒后用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，获得约530 bp的E4orf1编码序列片段（图2）。此外，基因测序结果进一步证实与GenBank报道的序列一致（序列略）。

2.3 筛选稳定转染MSCV-N E4orf1的HFLSECs的最佳药物浓度

在含0.5 μg/mL嘌呤霉素的培养条件下，原本贴壁生长的原代培养的HFLSECs从第2 d起开始逐渐变圆，第3 d起逐渐漂浮到培养基中（图3），5 d内基本观察不到贴壁生长的细胞，而在1、2、4 μg/mL嘌呤霉素培养条件下，原代培养的HFLSECs第2 d便全部漂浮，药物作用过强，因此，选择0.5 μg/mL嘌呤霉素为最适药筛浓度。

图1 原代培养的HFLSECs高表达vWF

图2 质粒MSCV-N E4orf1的酶切鉴定

图3 嘌呤霉素的最佳药物浓度筛选

2.4 逆转录病毒包装

包装20 h后即可见Plat-A细胞内有GFP表达，表达率超过90%（图4）。

图4 Plat-A细胞的GFP表达

2.5 E4orf1-GFP/HFLSECs可在无血清环境中存活

分别包装质粒MSCV-N E4orf1和pMX-GFP为逆转录病毒，收集毒液按1∶1的比例同时转染HFLSECs，并采用0.5 μg/mL嘌呤霉素加压筛选1周，再进行流式细胞分析，其GFP阳性率为90.5%，通过流式分选获得GFP+细胞（图5），分选后的E4orf1-GFP/HFLSECs能在含0.5 μg/mL嘌呤霉素的培养基中稳定扩增传代（图6），将其转入无血清的EGM-2中进行培养，仍能维持存活且并不增殖（图7）。

图5 流式分选中E4orf1-GFP/HFLSECs的GFP表达率

图6 分选后E4orf1-GFP/HFLSECs的GFP表达

图7 无血清环境下的E4orf1-GFP/HFLSECs

2.6 流式细胞术检测E4orf1-GFP/HFLSECs的表面标志

流式细胞检测结果（图8）显示，E4orf1-GFP/HFLSECs的内皮细胞表面标志CD144和CD31的阳性率分别为99%和99.5%，而干细胞表面标志CD117、内皮祖细胞表面标志CD133及血细胞表面标志CD45则几乎不表达，血管内皮生长因子受体KDR表达率为69%。

图8 流式分析E4orf1-GFP/HFLSECs的表面标志

2.7 E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层支持人脐带血来源的CD34+细胞的体外扩增

每3 d计数各组中悬浮的有核细胞总数，结果表明，在E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层的体外扩增体系中，人脐带血来源的CD34+细胞15 d有核细胞总数扩增了360倍，而作为对照的单纯因子悬浮培养组仅扩增了165倍，实验组的扩增效率是对照组的2.2倍（图9）。

图9 E4orf1-GFP/HFLSECs促进HSPCs的体外扩增*P＜0.05

2.8 人脐带血来源的CD34+细胞经过体外扩增后仍具有造血集落形成能力

在以E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层的体外扩增体系中，人脐带血来源的CD34+细胞经过扩增后在体外仍具有分化为不同CFU的能力（图10），包括红系爆式集落形成单位（BFU-E）、红系集落形成单位（CFU-E）、粒系集落形成单位（CFU-G）、巨核系集落形成单位（CFU-M）、粒系和巨噬系集落形成单位（CFU-GM）及红系、粒系、巨核系、巨噬系混合集落形成单位（CFUEGMM）。

图10 扩增后细胞在体外仍具有多系分化能力

3 讨论

1978年Schofield首次提出了干细胞龛（niche）的概念，指出特异性的微环境会对干细胞功能产生作用，随后有大量研究证实了多种组织中干细胞龛的存在[11-13]。目前，维持HSCs自我更新的造血微环境至少包括3个解剖区域（骨内膜、血窦壁和固有造血组织）和多种细胞类型（成骨细胞、血窦内皮细胞、脂肪细胞、基质细胞和免疫细胞等）。人们曾尝试多种方式来模拟体内造血微环境，以期望构建维持HSCs自我更新与扩增的体外培养体系，如造血相关的细胞因子、小分子，基质细胞共培养，Notch配体等[14-18]，但效果仍然差强人意。

胎肝是胚胎发育时期HSCs迅速扩增的重要场所，以小鼠为例，当造血中心从背主动脉和胎盘迁移至胎肝后，仅仅4 d，HSCs在其中完成近40倍的扩增。已有研究证实[19-20]，肝血窦是肝脏内造血集落的形成场所，而其中的肝窦内皮细胞对于髓外造血以及HSCs在肝小叶区的选择性植入具有关键作用，是重要的肝内造血微环境因素之一。有鉴于此，我们拟建立胎肝窦内皮细胞饲养层作为造血微环境平台。考虑到血清会影响血管的功能，干扰造血干祖细胞的扩增，所以与HSCs共培养时实现饲养层细胞的无血清存活是至关重要的。而原代内皮细胞在无血清、无血管内皮相关因子（如VEGF、FGF、IGF、EGF等）的条件下会丧失功能并迅速凋亡。已有文献揭示腺病毒的E4orf1在激活存活通路的同时，并不会促进内皮细胞的扩增和转化，可以作为生存蛋白，使内皮细胞即便在无血清的条件下仍然存活、维持内皮细胞的特性且不争夺与之共培养细胞的营养[7]，因此我们采用逆转录病毒系统并利用载体上的嘌呤霉素抗性基因筛选获得稳定转染E4orf1的HFLSECs。此外，为了便于日后应用于多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程获得HSCs时与起始细胞进行区分，我们共转染了表达GFP的逆转录病毒载体，并通过流式分选进行纯化。实验结果显示，该细胞的组织特异性在转染前后并未发生转变，仍能保留原代HFLSECs的内皮特性如vWF的表达，且能在无血清培养状态下正常存活，适宜作为HSCs体外扩增培养体系中的饲养层细胞。

与以往报道的以饲养层细胞提供微环境促进HSCs体外扩增方法[21]相比，E4orf1-GFP/HFLSECs无须经过丝裂霉素C或放射线的预处理，而且能在无血清培养状态下维持内皮细胞的特性，可以更好地为HSCs提供体外扩增微环境。初步实验结果表明，在E4orf1-GFP/HFLSECs的支持下，人脐带血来源的CD34+细胞在连续培养15 d后有核细胞总数扩增了360倍，而最近报道的胎肝细胞[22]或内皮祖细胞[23]仅仅实现了短期（7 d）扩增，有核细胞总数扩增效率分别为8倍和130倍。

综上所述，我们建立了能够在无血清、无内皮细胞相关因子条件下存活的内皮微环境平台，以此作为饲养层细胞可以为HSCs体外扩增、多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程获得HSCs带来新的研究思路和方法。