贝母中环阿屯醇合成酶的生物信息学分析

许勇，李静，蔡标，王红萍，戴陈伟，王娟

安徽省医学科学研究院 微生物研究所，安徽 合肥 230061

贝母是传统的药用植物，其鳞茎入药具有止咳化痰、清热散结等功效，在我国主要分布于四川、新疆、甘肃、湖北、安徽、浙江等省区[1-2]，包括川贝母、浙贝母、暗紫贝母、皖贝母等多个品种。贝母甲素、贝母乙素、炉贝甲素、川贝酮和西贝素等5α-瑟文类异甾体生物碱是贝母的主要生物活性成分[2]。

环阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase，CAS）属于氧化鲨烯环化酶（oxido squalene cyclase，OSC）家族，能够催化2，3-氧化鲨烯环化生成环阿屯醇，不仅是植物甾醇合成过程中的关键酶，同时又是三萜类物质合成的重要调控位点[3]。研究表明，贝母甲素等生物碱与萜类化合物合成途径相似，都属于甲羟戊二酸（mevalonic acid，MVA）途径，因此，CAS也是贝母素甲等生物碱的合成途径中的关键酶[4]。

应用生物信息学手段，分析预测药用植物中生物活性物质合成途径中关键蛋白质的性质、结构和功能，在对其生物合成机制的研究中得到广泛应用。已有学者用生物信息学手段对红花中的查尔酮合成酶[5]和金银花绿原酸合成酶[6]进行了预测分析，探究其生物活性物质的合成机制。

本研究旨在通过ProtParam、SignalP4.1、Scan-Prosite、ProtScale和SWISS-MODEL等生物信息学手段，分析预测贝母中环阿屯醇合酶的性质、结构和功能，为进一步研究贝母活性生物碱的生物合成调控机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

浙贝母（Fritillaria thunbergii）环阿屯醇合成酶（FtCAS）氨基酸序列下载自NCBI网站（Gen-Bank登录号：AEO27878）。

1.2 生物信息学分析

利用ProtParam分析浙贝母环阿屯醇合成酶的理化性质，SignalP[7]预测信号肽，PSORT预测细胞亚定位，TMHMM进行跨膜结构分析，ProtScale预测亲疏水性[8]，SOMPA预测二级结构[9]，Predict-Protein[10]预测二硫键，PROSITE预测功能位点，COILS[11]预测卷曲螺旋，SWISS-MODEL[12-16]进行同源建模，用MolProbity软件中的Ramachandran[17]对建模结果进行评估，3DLigandSite[18]预测配体结合位点。

2 结果

2.1 FtCAS的一级结构及理化性质分析

ProtParam分析结果显示FtCAS由756个氨基酸残基组成（表1），其中比例最高的为Leu（9.5%），比例最低的为Cys（2.4%）。FtCAS的相对分子质量为85 507.69，理论等电点（pI）为6.02，带负电氨基酸残基（Asp+Glu）总数为82，带正电氨基酸残基（Arg+Lys）总数为69，半衰期大于20 h，不稳定系数36.85，总平均亲水系数为-0.223，是稳定的亲水性蛋白质。

表1 FtCAS的氨基酸组成

2.2 FtCAS的信号肽、亚细胞定位、跨膜结构域和亲疏水性分析

通过SignalP4.1 Server分析发现，FtCAS的自然分裂位点分值（C-Score）的峰值为0.118（第38位），组合分裂位点分值（Y-Score）的峰值为0.123（第12位），不存在信号肽（图1）。PSORT细胞亚定位预测FtCAS位于细胞质中的微体或过氧化物酶体。应用TMHMM Server v.2.0对FtCAS进行跨膜结构分析（图2），发现该蛋白不含跨膜结构域（TMHs），非跨膜螺旋区（ExpAA）为 15.8607（＜18），预测表明该蛋白非跨膜蛋白；蛋白的N端位于膜内侧的概率为0.029 74，该序列总体位于膜外。通过ProtScale对FtCAS的氨基酸序列的亲疏水性进行在线预测，多肽链中的第126位脯氨酸的疏水值为1.944，是疏水性最强的氨基酸，第358位谷氨酸的疏水值为-2.778，是亲水性最强的氨基酸。N端和C端都是负值，都显亲水性，整条肽链中亲水性氨基酸残基数多于疏水性氨基酸残基（图3），可以预测FtCAS为可溶性亲水蛋白。

图1 SignalP4.1预测FtCAS的信号肽

图2 TMHMM分析FtCAS的跨膜性

图3 ProtScale预测FtCAS的亲疏水性

2.3 FtCAS的二级结构分析

利用SOMPA对FtCAS的二级结构进行分析预测，发现其二级结构中，α螺旋占43.92%（332个氨基酸残基），延伸链结构占13.76%（104个氨基酸残基），β转角占7.14%（54个氨基酸残基），无规卷曲占35.19%（266个氨基酸残基）。α螺旋和无规卷曲是FtCAS二级结构的主要构成原件。

PredictProtein预测结果表明FtCAS中不存在二硫键；PROSITE蛋白质功能位点分析发现1个萜类合酶位点（603～617 aa），其氨基酸序列为DGSWYGSWAVCFTYG。

2.4 FtCAS的卷曲螺旋域分析

如表2所示，通过COILS分析，发现FtCAS在Window=14时卷曲概率最高，为0.142，小于0.5，所以FtCAS不含卷曲螺旋结构。

表2 COILS预测的最高倾向性氨基酸区段

2.5 FtCAS的三级结构建模及结合位点预测

如表3和图4，SWISS-MODEL建模以PDB ID1w6j.1的A链为模板，序列一致性为50.16%，相似度0.44，覆盖度0.84，功能预测为羊毛甾醇合成酶。模型的总体评价为0.69，Qmean为-2.60。Ramachandran评估结果表明同源建模显示氨基酸位点都位于最佳区域内的占94.8%（614/648），氨基酸位点位于允许区域范围内的占98.5%（638/648），说明所建三级结构模型均准确可靠（图5）。3DLigandSite以PDB ID 1w6k的A链为折叠子，预测得到FtCAS的结合配体为 Zn2+，结合位点为 676His、677Ala、678Val、679Asn、682Trp和723Ala（图6）。

表3 FtCAS同源建模及功能预测

图4 SWISS-MODEL对FtCAS三级结构的预测

图5 MolProbity Ramachandran分析FtCAS的三级结构

图6 3DLigandSite预测FtCAS配体结合位点图中蓝色部分为配体结合位点

3 讨论

FtCAS整条肽链中亲水性氨基酸残基数多于疏水性氨基酸残基，其二级结构中富含α螺旋和无规卷曲，有助于保持蛋白质结构的稳定，总体来说，FtCAS是稳定的亲水性蛋白质。根据信号肽分析、亚细胞定位和跨膜结构域预测，FtCAS是位于细胞质内微体中的非分泌蛋白，和其所催化的MVA途径反应场所一致[19]，这也证明了预测的可靠性。

FtCAS中不含二硫键，这可能是由于其Cys残基含量低并且在催化功能中发挥关键作用[20]。蛋白质分子内或分子间的卷曲螺旋结构主要与分子识别、细胞骨架和细胞运动等功能相关[21]，Ft-CAS中不含卷曲螺旋结构也不发挥上述功能。

萜类合酶是萜类合成的核心酶，其催化产物多为环状，又称环化酶[22]。FtCAS的603～617 aa区域被预测为功能位点，发挥萜类合酶作用，与该酶的功能相符。萜类合酶的催化过程需要金属离子作为辅助因子[22]，FtCAS的辅助因子可能为 Zn2+，结合位点为676His、677Ala、678Val、679Asn、682Trp和723Ala。

CAS和羊毛甾醇合成酶的催化底物都是2，3-氧化鲨烯，产物环阿屯醇和羊毛甾醇为同分异构体，催化过程中2，3-氧化鲨烯都会经历“椅-船-椅”构象，产生C-20原甾醇阳离子中间体，并进行骨架重组，最终生成终产物[3]。因此，SWISSMODEL和3DLigandSite都以羊毛甾醇合成酶为模板，建立FtCAS的三级结构模型。

通过生物信息学手段对FtCAS的分析预测结果与其实际功能有很强的联系，证明预测结果的可靠性较高，可以以此为基础进一步探讨贝母中生物碱合成的调控机制。