EB病毒再激活后鼻咽癌细胞系中基因表达差异分析

李明阳，马春霞，吴翰欣，吴小海，俞建昆

1.中国医学科学院北京协和医学院 医学生物学研究所中心实验室，云南 昆明 650118；

2.昆明医学大学 附属第二医院，云南 昆明 650118

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是常见于我国南方及东南亚地区的鼻咽部恶性肿瘤，尤其高发于广东省[1]。鼻咽癌的发病与Epstein Barr病毒（Epstein Barr virus，EBV）感染、遗传因素及环境因素密切相关[2-6]。EBV的再激活与NPC的发展之间存在一定的相关性。随着高通量测序技术及基因芯片技术的发展，从不同层次如基因组、转录组及蛋白质组等方面研究恶性肿瘤的发生发展以及预后已成为全世界科学家的首选方法[7-9]。基因芯片的贡献者先前已证明低剂量的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）与12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）和丁酸钠（SB）具有协同作用，用于增强携带EBV的NPC细胞中的EBV再激活和基因组不稳定性[10]。在此，我们利用生物信息学方法筛选EBV再激活后NPC细胞的差异表达基因（differentiallyexpressed genes，DEGs），为相关临床研究提供重要的信息基础。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞基因表达谱下载自NCBI的GEO DataSet数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov），编号为GSE38453，该芯片中包含2种鼻咽癌细胞系NA细胞NA-P10/TS-MG和NA-P1/mock的表达谱。NA-P10/TS-MG是指具有10次组合的TPA/SB和MNNG（TS-MG）处理的NA细胞，通过将这些细胞与 TPA/SB（10ng/mL和 1.0mmol/L）及 MNNG（0.1 μg/mL）组合周期性温育来对NA-P10/TSMG细胞进行10次重复化学暴露。NA-P1/mock是经过1次传代的模拟处理的NA细胞。每种细胞均有2次重复。

1.2 方法

利用R语言程序包（edgR包）筛选差异表达基因并绘制基因表达热图（标准设置：差异表达倍数∣FC∣＞1，FDR＜0.05，P＜0.05）。利用在线分析工具（https://david.ncifcrf.gov/和http://www.string-db.org/）对筛选出的候选基因进行GO富集、KEGG通路分析及蛋白互相作用网络分析，以确定核心基因。P＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 差异基因分析

EBV经过化学再刺激后，从鼻咽癌细胞系中共筛选出4496个DEGs，包括1954个上调基因和2542个下调基因（P＜0.05）。选取前50个绘制基因表达热图（图1），并选取前246个DEGs进行后续分析。

图1 基因表达热图（Top 50）

2.2 GO基因富集分析

GO分析结果显示，DEGs在生物过程（biological processes，BP）中显著富集，包括病毒应答、Ⅰ型干扰素信号通路、γ干扰素介导的信号传导途径、病毒防御反应、胆固醇生物合成过程、氧化还原过程、类异戊二烯生物合成过程、类固醇代谢过程、脂质代谢过程和花生四烯酸代谢过程（表1）；在分子功能（molecular function，MF）中，包括丝氨酸型内肽酶活性、蛋白同二聚化活性、醛脱氢酶（NAD）活性、氧结合、3-氯烯丙基醛脱氢酶活性、血红素结合、谷胱甘肽转移酶活性、氧化还原酶活性、铁离子结合和药物结合（表2）；在细胞组分（cell component，CC）中，包括胞外体、细胞质、细胞器膜、基底外侧质膜、胞外空间、内质网膜、内质网、过氧化物酶体、线粒体、顶端质膜（表3）。

表1 生物过程分析结果（Top 10）

表2 分子功能分析结果（Top 10）

表3 细胞组分分析结果（Top 10）

2.3 KEGG通路分析

如表4，KEGG通路分析显示，DEGs在代谢途径、抗生素生物合成、萜类骨架生物合成、化学致癌作用、丙型肝炎、胆汁分泌、细胞色素P450代谢外源性物质、氨基酸生物合成、类固醇生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等信号通路中显著富集。

2.4 候选基因蛋白产物互相作用分析

在蛋白互作分析网络中，MAPK3、IRF7、IRF9、IFI6、TRIM22、IFI27、OAS2、TRIM31、HLA-F和MX1节点度最高，即为核心基因（图2）。

图2 候选基因蛋白产物相互作用

3 讨论

EBV是导致鼻咽癌的主要因素，化学致癌物对其的激活作用可能在NPC的发展中起重要作用。已证明TPA和SB可以诱导EBV的再激活，从而增强鼻咽癌细胞的基因组不稳定性和肿瘤发生率[10-11]。此外，联合治疗时，低剂量MNNG（0.1 μg/mL）与TPA/SB具有协同增效作用[12]。由于鼻咽癌高风险地区的居民可能以长期低剂量重复的方式接触这些致癌物，我们试图确定携带EBV的鼻咽细胞暴露于致癌物的后果。

通过生物信息学分析，我们发现EBV再激活后，宿主细胞中1954个基因上调、2542个基因下调，这些基因主要在代谢途径、抗生素生物合成、萜类骨架生物合成、化学致癌作用、丙型肝炎、胆汁分泌、细胞色素P450代谢外源性物质、氨基酸生物合成、类固醇生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等信号通路中显著富集，为相关临床研究提供了重要的信息基础。