铜绿假单胞菌外膜蛋白OprⅠ原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

刘潇，李文桂,罗广旭

重庆医科大学附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆 400016

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,Pa）是医院内感染的主要致病菌之一。Pa易定植且易耐药，可导致囊性纤维化或免疫力低下等患者发生难治性感染[1-2]。2014年全国医院感染横断面调查报告显示，下呼吸道感染所分离的病原体中Pa数量（1573/7477株）居首位[3]。2016年中国CHINET细菌耐药性监测结果显示，广泛耐药的Pa菌株检出率为2.1%，呈上升趋势[4]。若Pa感染未得到及时治疗或彻底治愈，转变为慢性感染，会使得治疗难度加大。疫苗的应用弥补了细菌的耐药性和抗菌药物长期大量使用产生的菌群失调等不足，为Pa的防治提供了新的思路[5]。

外膜蛋白Ⅰ（outer membrane proteinⅠ，OprⅠ）是一种结合在肽聚糖上的脂蛋白[6]，其脂质尾是其有效发挥多种类型免疫应答的重要成分之一[7-8]。Westritschnig 等[9-10]将 OprⅠ疫苗免疫健康志愿者，发现其可诱导血清特异性IgG抗体升高，提示OprⅠ是一种有希望的疫苗分子。我们拟将OprⅠ基因插入原核表达载体pGEX-1λT，构建pGEX-OprⅠ，再将其电穿孔转化大肠杆菌BL21（DE3），研究该重组质粒在大肠杆菌中的表达，为Pa疫苗研制提供有价值的材料。

1 材料与方法

1.1 材料

Pa的PA01株由重庆医科大学附属儿童医院余加林教授惠赠；pGEX-1λT和大肠杆菌BL21（DE3）由本室保存。

DNA抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购于上海生工公司；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶、T4DNA连接酶购于Fermentas公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购于北京鼎今生物科技公司；Pa感染的鼠血清、LB液体和固体培养基由本室保存。

恒温摇床购于日本三洋公司；高速离心机、电穿孔仪购于德国Eppendorf公司；PCR仪、凝胶成像分析仪、电泳仪购于美国Bio-Rad公司。

1.2 OprⅠ基因的扩增及鉴定

根据GenBank中Pa的OprⅠ基因序列和pGEX-1λT 载体特点设计引物 P1（5′-GCGGATTC TGAGCAGCCACTCCAAAGAAACGAAGCT-3′，下划线处为BamHⅠ酶切位点）、P2（5′-GCGAATTCCT ATTACTTGCGGCTGGCTTTTTCC-3′，下划线处为EcoRⅠ酶切位点），由上海生工公司合成。取Pa菌种PA01株加入LB液体培养基中，37℃、220 r/min振荡培养48～72 h至细菌浓度约为109/mL，10 000 r/min离心1 min，弃上清液，按照DNA抽提试剂盒说明书提取DNA。以Pa基因组DNA为模板，以P1和P2为引物，PCR扩增OprⅠ片段。50 μL PCR反应体系包括2×PCR Master 25 μL、引物各 2 μL、DNA 模板 3 μL、灭菌双蒸水 18 μL。扩增条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；最后72℃延伸2 min。取PCR产物5 μL进行12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3 重组质粒pGEX-OprⅠ的构建

将 BL21（pGEX-1λT）接种在氨苄青霉素（Amp）浓度为50 μg/mL的LB固体培养基上，37℃培养16～18 h，挑选单克隆菌落接入Amp浓度为50 μg/mL的LB液体培养基中，37℃、200 r/min振荡培养48～72 h，用质粒抽提试剂盒提取pGEX-1λT。

OprⅠ的PCR扩增产物和载体pGEX-1λT均经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切体系总体积均为 60 μL，包括 42 μL 扩增产物或载体、1.3 μLBamHⅠ、1.3 μLEcoRⅠ、6 μL 10×Tango缓冲液、9.4 μL灭菌双蒸水。37℃水浴酶切2 h。按照PCR产物纯化试剂盒说明书对酶切产物进行纯化。

将OprⅠ基因片段与载体片段混匀（摩尔比5∶1），连接体系（20 μL）包括 OprⅠ基因片段 4μL、载体片段12 μL、10×T4DNA连接酶缓冲液2 μL、T4DNA连接酶2 μL。5000 r/min离心15 s，4℃连接过夜，70℃水浴10 min灭活连接酶。

按照高效感受态细胞制备试剂盒说明书制备感受态大肠杆菌 BL21（DE3）。取 80 μL 感受态菌液与20 μL连接产物充分混匀，冰浴1 min，转移至电击杯中。电穿孔（电穿孔参数：0.8～2.5 kV，5 ms/次，1～5次）结束后继续冰浴5～10 min，然后转移至培养管中，37℃、150 r/min振荡培养1 h，取适量菌液划线接种至含 Amp（50 μg/mL）的LB固体培养基上，37℃培养72 h。

1.4 重组质粒pGEX-OprⅠ的鉴定

挑选单克隆菌落接入含 Amp（50 μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养48～72 h，收集菌体，抽提质粒，用上述酶切体系进行双酶切鉴定。以抽提的质粒为模板，按上述方法扩增OprⅠ基因。

1.5 大肠杆菌BL21（pGEX-OprⅠ）的诱导表达及SDS-PAGE分析

阳性重组菌振荡培养至菌液D600nm值为0.5～0.8，取部分做对照，其余加入1 mmol/L的IPTG，分别在诱导后1、3、5、7、9、11和13 h收集菌体，与50 μL 1×蛋白加样缓冲液混匀，煮沸5 min，分别取20 μL加样进行SDS-PAGE。

1.6 Western印迹鉴定

SDS-PAGE结束后，150 mA、2 h恒流电转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，用1∶100稀释的Pa感染的鼠血清（一抗）室温孵育2 h，用1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG（二抗）室温孵育2 h，用现配的二氨基联苯胺显色液避光反应15～20 min进行显色并成像。

2 结果

2.1 OprⅠ抗原编码基因的鉴定

以PA01株的基因组DNA为模板进行PCR，可获得约194 bp的OprⅠ基因片段（图1）。

图1 OprⅠ抗原编码基因PCR扩增产物鉴定

2.2 重组质粒pGEX-OprⅠ的双酶切鉴定

以pGEX-1λT空载体为对照，从具有Amp抗性的重组菌中提取重组质粒，经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后产生约4947 bp的pGEX-1λT载体片段和194 bp的OprⅠ基因片段（图2）。

图2 pGEX-OprⅠ的双酶切鉴定

2.3 重组质粒pGEX-OprⅠ的PCR鉴定

从具有Amp抗性的重组菌中抽提质粒，以此为模板，以P1和P2为引物进行PCR，可扩增出约194 bp的OprⅠ基因片段（图3）。

图3 重组质粒pGEX-OprⅠ的PCR扩增产物鉴定

2.4 大肠杆菌BL21（pGEX-OprⅠ）表达产物的SDS-PAGE分析

IPTG诱导BL21（pGEX-OprⅠ）表达相对分子质量（Mr）约32 000的GST-OprⅠ融合蛋白（GST的Mr约 26 000，OprⅠ的Mr约 6000）。凝胶成像分析结果提示蛋白表达量在IPTG诱导3～5 h时较高，融合蛋白约占菌体总蛋白的20%（图4）。

图4 重组菌BL21（pGEX-OprⅠ）表达产物的SDS-PAGE分析

2.5 Western印迹鉴定

Pa感染的鼠血清可识别大肠杆菌BL21（pGEX-OprⅠ）表达的GST-OprⅠ蛋白，识别的条带Mr约32 000，与预期相符（图5）。

图5 BL21（pGEX-OprⅠ）表达产物的Western印迹鉴定

3 讨论

Fruh等[11]以pITaq1为模板扩增OprⅠ基因，将其克隆入pQE构建pQE8-I，转化大肠杆菌M15/pREP4，IPTG诱导表达Mr约8000的重组OprⅠ蛋白，Western印迹证实小鼠单克隆抗体（mAb）2A1可识别该重组OprⅠ蛋白，von Specht等[10]将此重组OprⅠ蛋白免疫健康志愿者可诱导特异性免疫应答。Finke等[12-13]将OprⅠ基因克隆至pTaq获得重组质粒pITaq1，转入大肠杆菌表达Mr约8000的重组OprⅠ蛋白，Western印迹提示表达的OprⅠ蛋白可与小鼠mAb结合，以纯化的重组OprⅠ蛋白接种小鼠可诱导其产生抵抗Pa感染的保护力。陈春琳等[14]提取PA01株基因组DNA，PCR扩增获得252 bp的OprⅠ基因，与pET-32a连接获得重组质粒，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达Mr约30 000的OprⅠ融合蛋白，Western印迹证实免疫鼠血清可识别该融合蛋白，纯化的OprⅠ蛋白免疫昆明鼠可产生显著的保护力。这些研究表明OprⅠ蛋白能够诱导机体产生较好的保护性免疫应答，在Pa疫苗的研究方面具有重要价值。

本研究采用大肠杆菌表达系统。大肠杆菌作为宿主菌具有遗传背景清楚、可供选择的高效表达载体多、目标蛋白表达量较高、培养条件简单且周期短和不易污染等优点。BL21（DE3）是常用的蛋白酶基因缺陷株，可使目标蛋白的稳定性较其他表达菌株增强。pGEX-1λT源于pBR322，是一种以大肠杆菌为宿主菌的高效融合型表达载体，pGEX-1λT的多克隆位点上游有一个谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因和一个凝血蛋白酶切割位点的编码序列，目标基因插入后，产生的融合蛋白由3个序列构成。GST在大肠杆菌中容易表达，与其构成的融合蛋白具有较高的可溶性和酶活性。GST基因上游的tac启动子由lacUV5的Pribnow序列与trp启动子的-35序列拼接而成，其mRNA转录水平远高于lacUV5和trp启动子，所有的tac启动子都可被IPTG诱导进而高效表达外源基因。近年来，众多学者使用pGEX-1λT和BL21（DE3）研究目的基因的表达，张宁等[15]利用pGEX-1λT使日本血吸虫Sj-14-3-3基因在BL21（DE3）中表达，张丽等[16]将日本血吸虫Sj26GST基因插入 pGEX-1λT，导入 BL21（DE3）后可表达目的蛋白。本研究构建了重组大肠杆菌BL21（pGEX-OprⅠ），其表达的融合蛋白可被Pa感染的鼠血清特异性识别，与上述研究[14-16]相似，提示OprⅠ基因可在BL21（DE3）中表达，且表达的蛋白具有抗原性。