肺癌中SOX4基因的调控网络分析验证和蛋白质预测
2018-08-29李明阳马春霞吴翰欣吴小海俞建昆
李明阳，马春霞，吴翰欣，吴小海，俞建昆
1.中国医学科学院北京协和医学院 医学生物学研究所中心实验室，云南 昆明 650118；
2.昆明医学大学 附属第二医院，云南 昆明 650118
SOX（SRY-related HMG-box）家族作为一类转录因子，参与调控胚胎的发育和分化，也参与胚胎发育中的性别决定、神经系统形成和血管系统发育等过程。该家族成员含有一段高度保守的HMG-Box序列，具有DNA结合蛋白的特性。近年来随着高通量测序技术及基因芯片技术的发展[1-3]，在多种恶性肿瘤中发现该家族的重要成员之一SOX4表达异常。目前已有相关报道证明SOX4基因与肺癌相关，对肺癌的诊断、治疗、疗效及预后评估等均有重要意义[4-5]。该基因在肺癌中受到的调控机制尚未完全明晰。因此，我们利用生物信息学方法对SOX4基因可能存在的调控机制进行了预测，为进一步证明该基因与肺癌的关系奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
自NCBI的GenBank数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）检索并下载人类（HOMO）SOX4基因全长序列及编码蛋白的氨基酸序列（HOMO ID：6659，NC_000006.12），保存为FASTA格式以便进行后续分析。
1.2 生物信息学预测
用 Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）工具分析SOX4基因的蛋白产物；用在线分析软件GCBI（https://www.gcbi.com.cn/）分析SOX4基因的调控网络。
1.3 实时荧光定量PCR
利用特异性茎环引物对目标微小RNA（microRNA，miRNA）进行反转录，引物见表1。检测仪器为Roche Light Cycle 480Ⅱ，试剂为HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis kit和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix。细胞系样品为正常人胚肺成纤维细胞（KMB17）和肺癌细胞系（A549和H1299），临床样本为20对肺癌病人癌组织与癌旁组织（昆明医科大学肿瘤医院提供）。
表1 引物及序列
2 结果
2.1 SOX4蛋白相关指数测定
人类SOX4蛋白分子组成为C14497H24117N4879O6053S1249，相对分子质量403 657.95。共有4879个氨基酸残基，其中甘氨酸残基含量最高为26.9%，等电点4.71。在哺乳动物体外，该蛋白的半衰期为4.4 h，不稳定指数为46.53，因此判定为不稳定蛋白。溶脂系数为23.45，亲水性的总平均值为0.786。
2.2 SOX4蛋白互作网络分析
如图1所示，通过在线预测，人SOX4蛋白可与TP53、DICER1和SDCBP2蛋白相互作用。
图1 人类SOX4蛋白互作图
2.3 SOX4基因调控网络分析
如图2、3所示，人SOX4基因受多种长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和miRNA的调控，其中miRNA-30家族未有文献报道证实其与SOX4存在调控关系，因此我们对miRNA-30s进行qPCR测定。
图2 可能调控SOX4基因的lncRNA
图3 可能调控SOX4基因的miRNA
2.4 qPCR验证miRNA-30s表达量
如图4、5所示，hsa-miR30s在临床样本中的表达模式不完全相同。与癌旁组织相比，hsamiR30c-5p和hsa-miR30d-5p在癌组织中低表达，而hsa-miR30d-5p则相反；与正常人胚肺成纤维细胞KMB17相比，肺癌细胞系A549和H1299中3个miRNA-30成员的表达模式均为高表达，这也与前期预测相反。
图4 临床样本中miRNA-30s的表达量
图5 细胞系中miRNA-30s的表达量
3 讨论
作为胚胎发育中调节增殖和分化的基因，SOX4在肺癌中显著高表达，提示其与肿瘤的发生发展有关。现有研究证明SOX4基因可调节细胞信号通路，影响细胞增殖、分化和凋亡等过程，并利用miRNA调控网络促进或抑制肿瘤生长[6-9]。但该基因在肺癌中的具体机制尚未完全明确，因此我们利用生物信息学分析方法对SOX4基因可能存在的调控机制进行了预测。研究结果显示，SOX4蛋白可与TP53、DICER1和SDCBP2蛋白发生相互作用；在基因水平上，SOX4基因受多种lncRNA和miRNA的调控。miRNA与目标基因一般为负性调控模式[10-12]，而本研究中qPCR结果与前期预测并不完全一致，由此提示虽然生物信息学可在前期为实验设计开辟道路，但仅靠生物信息学的分析结果并不十分严谨，必须将软件预测分析和实验验证结合起来，方能得到可信度最高的结果，为进一步证明目标基因与疾病的关系提供科学有效的数据基础。
